亲水相互作用色谱-高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1198～1202DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150228亲水相互作用色谱-高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖吴成玲刘建芬张真庆(苏州大学药学院，苏州215123)。(协和制药，石家庄050083)摘要建立了亲水相互作用．液相色谱．质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。在高分辨质谱联用条件下，流动相5mmol／L醋酸铵缓冲溶液可有效使用。在此基础上，对不同的色谱柱进行了筛选。其中，氨基亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离

2、效果不佳；酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡糖的分析，可以有效分离聚合度2～加的透明质酸寡糖；在较高温度下，两性离子基质的亲水相互作用色谱柱可以对聚合度2—30的透明质酸寡糖和聚合度2—12的硫酸软骨素寡糖有效分离；而二醇基亲水相互作用色谱柱对透明质酸(聚合度2—30)、硫酸软骨素(聚合度2—20)以及肝素(聚合度4—20)都适用，并呈现出较好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度、不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖的分离特点，建立了相应的高效分离和分析方法。本方法有较高的分辨率和质谱适用性。关键词亲水相互作用色谱；四极杆／时间飞行质谱；糖胺聚糖；寡糖

3、1引言糖胺聚糖是在细胞表面和细胞间基质中被发现的呈线性的酸f生多糖。糖胺聚糖通过调节多种细胞活动从而参与到生理和病理学过程中，如细胞的扩增和分化，细胞与细胞的相互作用以及细胞与细胞间基质的相互作用等]。糖胺聚糖基于它们的单糖组成以及单糖之间糖苷键的位置和构象，可以大体分为4类：透明质酸(HA)，硫酸皮肤素／硫酸软骨素(DS／CS)，硫酸乙酰肝素／肝素(HS／HP)和硫酸角质素(KS)。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类、大小、糖组成、电荷密度和序列等J。相对于糖胺聚糖的其它结构特征，SO4一的数量(电荷密度)对于调节生物学功能来说具有更大影响。糖胺聚糖所含so4一数目多少

4、大体排序为HP>DSCSHS>HA。糖胺聚糖类寡糖经常被作为模型，用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、糖胺聚糖酶活力测定、糖胺聚糖降解程度、糖胺聚糖寡糖制备的监控，建立有效的糖胺聚糖寡糖在线分析方法至关重要。目前，用于分析糖胺聚糖类寡糖的方法有强阴离子交换(SAX)一高效液相色谱(HPLC)和反相离子对(IPRP)色谱¨等。然而，强阴离子交换色谱方法呈现出较低的分辨率和稳定性，同时它使用的高浓度的无机缓冲盐溶液限制了它与质谱的联用，从而无法在线检测所得寡糖的分子量、组成和序列；IPRP方法有较好的分辨率，而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱，但是它们通常残留

5、在离子源和毛细管中，从而降低了质谱的灵敏度和分辨率M。本研究针对具有不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖，采用4种基质的亲水相互作用色谱(HILIC)方法。研究表明，与SAX和IPRP方法相比，HILIC方法有更好的质谱兼容性；同时，针对不同的糖胺聚糖寡糖可以选择不同的HILIC方法。2实验部分2．1仪器与试剂Agilent1260Infinity液相色谱仪-串联四级杆／飞行时间(Q／TOF)质谱(6540，美国Agilent公司)。醋酸铵、硫酸软骨素一A(CS-A)和HA(美国Sigma公司)；乙腈(德国Merck公司)；软骨素ABC酶(Chondroiti—naseABC，北京艾德豪克国际技术有

6、限公司)；低分子量肝素：依诺肝素为美国药典标准品(USP)。2015-03-21收稿；2015-05-31接受本文系国家自然科学基金(No．81473179)资助}E—mail：liujianfen888@163．corn；z_zhang@suda．edu．ca第8期吴成玲等：亲水相互作用色谱．高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖2．2实验方法2．2．1酶水解制备HA寡糖、CS-A寡糖分别取2．0mgHA和cs—A样品溶于400酶解缓冲液(10mmol／L磷酸盐缓冲液，pH6．8)，将HA和CS—A样品配制成5mmL溶液，分别加入软骨素酶ABC5mU，置于水浴箱中37℃反应4h。酶解液高温灭活然

7、后离心，上清液备用。2．2．2寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析(I-IPLC-HILIC)流动相A为5mmol／L醋酸铵溶液，流动相B为5mmol／L醋酸铵-95％乙腈溶液，紫外检测器设置为232nm在线检测。氨基一HILIC色谱柱(250mmx4．6mm，5Ixm，日本COSMOSIL公司)；酰胺基一HILIC色谱柱(250minx4．6mm，5I．Lm，北京华谱新创公司)，柱温30％，流速0．5mL／min，30m