地黄中水苏糖的提取与分离实验.doc

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1、学院2014实验报告地黄中水苏糖的提取与分离实验一、前言水苏糖是天然存在的一种四糖，是一种可以显著促进双歧杆菌等有益菌增殖的功能性低聚糖，不被人体消化酶完全水解，热量为1.5-2.4kcal/g。因而可进入结肠，并被肠道细菌酵解利用。有对肠道有益菌如双歧杆菌、乳杆菌有特异性的增殖作用，具有抗便秘和腹泻的双重作用，有防龋齿的功能，可通过调节肠道pH值促进人体对钙、铁的吸收等特性[1]。根据水苏糖的理化和生物学特点，其应用十分广泛，在食品、药品、化妆品、饲料、酿酒、工业添加剂等领域都有广泛应用。水苏糖的生产方法有天然提取法和酶法两种，酶法生产

2、水苏糖是最近发展起来的方法，目前尚处于实验室阶段。天然提取法是目前水苏糖工业化生产中常用的方法，经过研究和工业化试点，该方法已经逐步成熟[2]。地黄中梓醇含量、还原糖和多糖的含量均为鲜品高于干品[4]，本次实验通过三种不同方法对熟地黄中水苏糖进行提取，比较水提取法、超声波提取法和微波提取法之间的区别，再通过乙醇沉淀、大孔树脂吸附过滤等方法纯化，以得到较纯的水苏糖。并通过HPLC-RID[4]高效液相色谱-示差折光检测器对样品中水苏糖进行检测，通过分析数据比较得出不同提取方法之间效率区别兵。二、材料及方法1.材料实验材料市售熟地黄（块状），

3、每组50-100g，共1kg。D101大孔树脂500g。试剂1）乙醇4L；实验用品（以下为每组用品，每组4人）1）50mL离心管×8个；2）50mL离心管架×1个3）1mL取液器×1只；4）1mL替补头×1盒；5）1000mL烧杯×1个；6）200-250mL烧杯×1个；7）20cm玻璃棒×1个；8）记号笔×1个9）50mL量筒；共用实验用品：1）称量用天平×2台；2）离心管平衡用台秤×2个；3）8-9cm布氏漏斗×5只；4）封口膜×1卷；5）8-9cm滤纸×4盒；6）剪刀×3把；7）层析柱（10mm×40cm）×5只；8）氨基C18柱；

4、9）0.22um水性滤膜（5cm）×1盒；10）计时闹钟×4个；5学院2014实验报告11）1000mL试剂瓶×1个；12）5mL离心管×3包；13）标签纸，若干；14）100mL量筒×2个；15）蒸馏水×1桶；16）手套×2包；17）1000mL量筒×1个；18）500mL量筒×1个；19）抽滤用缓冲瓶×5只（与布氏漏斗配套）2.XXXXX。指某项具体的研究方法（如XXX微生物培养、PCR、蛋白质纯化、酶活性测定、蛋白质的含量测定、C/N比对植物花芽分化的影响、pH对YYY酶活性的影响等）。3.YYYYYY。同上。4.液相色谱。同上。此

5、处所给出的实验技术中仅指具体的、主要的操作过程，不必写实验原理。也可以给出实验的注意事项。2.水苏糖的提取与浓缩-高温水煮法每组称取10g混匀后的地黄样品，置于250mL三角瓶中，加入提取液（蒸馏水）120mL，浸泡1h，然后置于100℃条件下煎煮1.0h，简单封口以保湿，期间不断搅拌（注意达到预定温度时的液面高度，以便适当补充水分以保持水分总量）。加热结束的溶液待放凉后，用双层滤纸进行过滤，滤液于旋转蒸发仪浓缩至原体积的约1/10，之后上述浓缩液于12000×g离心15min，迅速取出并保存好上清液（弃沉淀），该样品中不得含有任何可见颗

6、粒状杂质，标清样品号。3.水苏糖提取液的乙醇沉淀每组各取上述上清液（浓缩的提取液）6mL×2管，冰浴30min或以上，之后加入24mL冷乙醇，静置1-2h或过夜，然后10000×g离心15min，迅速倒掉上清液（弃），保存好沉淀，沉淀颜色呈黑色。然后在两管中各用纯乙醇约10mL将上述沉淀悬浮。相同条件下离心后，迅速倒出上清液（弃），保存好沉淀。之后沉淀于40-45℃干燥、恒重后，称重0.111mg。称重后溶解于12mL的去离子水中后用于液相色谱检测。4、水苏糖的大孔树脂吸附纯化1）大孔树脂柱的安装：取内径10mm、高度30-40cm层析柱

7、洗净后（实际柱高=22cm，体积=17.27mL），垂直架设，在其下部装入1/4-1/3的去离子水，然后将去离子水浸泡、清洗后的大孔树脂均匀倒入层析柱内，不少于25cm，用去离子水冲洗（平衡）。流速约10滴/min（0.5%柱体积/min）。2）进样与冲洗：柱子平衡后，使柱内液面降至与树脂面平，然后加入5mL的上述浓缩的提取液，液面下降至与树脂面平时，进样结束，然后加入5倍柱体积的去离子水进行冲洗层析柱（此过程称之为洗脱），收集5倍柱体积的洗脱液后，洗脱结束。洗脱液体积86(Y)mL。上述洗脱液中，于每个柱体积取一个样，用于液相色谱检测。

8、5.高效液相色谱检测水苏糖层析柱：氨基色谱柱，250*4.6监测：RID。流速：1ml/min。收集：2%柱体积/管（约2-3mL/管）或者见峰收集。5学院2014实验报告流动相：乙腈/纯水7