蛋白质的表达、分离、纯化实验.doc.pdf

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1、蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、W

2、ashingBufferElutionBufferIPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备1.LB液体培养基：Trytone10g，yeastextract5g，NaCl10g，用蒸馏水配至1000mL。2.氨苄青霉素：100mg/mL。3.上样缓冲液：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，10mM2-ME，pH8.0。4.WashingBuffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，pH6.3。5.ElutionB

3、uffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，500mMImidazole，pH8.0。6.IPTG：100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。二、获得目的基因1.通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2.通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行

4、PCR循环获得产物。三、构建重组表达载体1.载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2.PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。四、获得含重组表达质粒的表达菌种1.将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2.测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3.以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受

5、态细胞。五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1.接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2.按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8（最好0.6，大约需3h）。取10ul样品用于SDS-PAGE分析。3.对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，37℃继续培养1-3h。4.12000rpm离心10min，弃上清，菌

6、体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1.NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min，4℃12000rpm离心30min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS-PAGE分析。3.上清样品以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。4.洗脱杂蛋

7、白：用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280=0.01分步收集洗脱液，约3-4h，取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。5.洗脱目标蛋白：用ElutionBuffer洗柱，收集每1mL级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE分析。注意事项1.选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2.融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。3.菌液OD值要小于1，否则细胞太浓太老，不易破碎，

8、且质粒易丢失。4.诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。5.诱导温度适当摸索：25、30℃。6.I