我做了很久的western blot

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1、我做了很久的westernblot，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了。我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之westernblot提出以下建议，供刚入门的同仁参考：1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，

2、Cellsignaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cellsignaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fatmilk的TBST。4.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压

3、内标actin。个人整理WesternBlot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gS

4、DS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形

5、成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6.10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTri

6、s碱、0.37gSDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。10、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。11、脱脂奶粉5%(w/v)。12、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。4.2.4  22.聚丙烯酰胺凝胶溶液：分离胶12.5%,PH8.85ml10ml15ml超纯水1.5ml3.0ml4.5ml30%丙烯酰胺溶液2.1ml4.2ml6.4mlpH8.8、1.5mol/

7、LTris溶液1.3ml2.6ml3.8ml10%SDS0.05ml0.1ml0.15mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml10%过硫酸铵0.05ml0.1ml0.15ml浓缩胶：5%，pH6.8  2ml  4ml  6ml超纯水  1.4ml  2.8ml  4.1ml30%丙烯酰胺溶液  0.3ml  0.6ml  1.0mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液  0.25ml  0.5ml  0.75ml10%SDS  0.02ml  0.04ml  0.06mlTEMED  0.002ml  0.

8、004ml  0.006ml10%过硫酸铵  0.02ml  0.04ml  0.06ml一．配胶1．  注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。2．  分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后