猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能鉴定

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1、猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能鉴定I张必雄"2,熊祺琰"，王佳I,纪燕J倪博［韦艳娜-冯志新】，刘茂军1邵国青"(1江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室•国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014；2山西农业大学,太谷，山西030800)摘要：【目的】猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及屮耳炎等多种慢性炎症，感染率极高，口与人类肿瘤的发生有关，对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表而可变脂蛋口(vlp)家族参与了黏附宿主细胞过程，木试验主要详细研究vlp家族成员之一v

2、lpA的黏附宿主细胞功能，特别是其Illlxffi复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。【方法】根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列，设计引物，利用PCR扩增获得vlpA基因，或者人工合成HI区重复片段重复次数不等的一系列vlpA基因，均克隆于pET-32a(+)进行表达，获得冃的蛋白。同时利用固相合成法制备vIpAHI区重复肽段。用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验鉴定系列重组vlpA蛋口和肽段的黏附功能。【结果】通过诱导表达和银柱亲和层析纯化，成功获得纯度较高的各个目的蛋门。利用间接免疫荧光试验证实了vlpA参与介导猪鼻支原体黏附宿主细胞；利用微孔板黏附试验定量检测不

3、含III区肽段和含有重复次数为3、6、9、12次的III区肽段的vlpA重组蛋门，以及川区重复肽段的黏附能力，结果表明II区屮含有明显的黏附表位，而III区重复肽段没有明显黏附功能；vlpA的黏附能力与其III区重复次数有关，且随着重复次数增多，黏附能力下降。木研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。关键词：猪鼻支原体；可变脂蛋白vlpA；细胞黏附猪鼻支原体(MycoplasmahyorhinisMhyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及屮耳炎等多种慢性炎症［Z］,通常由母猪或大猪经呼吸道传染给小猪，进rfO从呼吸道侵染全身引发疾病的发生。猪鼻支原体

4、也是实验室细胞培养物的常见污染物⑸，同时近年來研究者在人胃癌组织屮检测到M.hyorhinis,并进而发1基金项目：国家自然科学基金项冃(31300155)；江苏省自然科学基金项冃(BK20130702)作者简介：张必雄(1989年・)，男，从事生物化学与分子生物学方向研究。水通信作者：邵国青，(Tel)025-84391973,(E-mail)gqshaojaas@163.com熊祺琰，(Tel)025-84390880,(E-mail)qiyanxiongnj@163.com现M.hyorhinis的感染与包括骨癌、人肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等在内的多种癌症有明显相关性，

5、提示M.hyorhinis与肿瘤的发生有关，对人类健康构成威胁【6叨。目前研究者大多认为支原体一般不通过直接的毒力因子致病，而是通过长期持续性感染引发机体慢性炎症应答而导致病变的发生。儿乎所有的人及动物支原体都通过最初的黏附宿主细胞从而实现后续的体内增殖和感染，因此黏附因子在支原体感染致病的过程中起着极为重要的作用。到冃前为止M.hyorhinis的黏附因子尚不清楚，这严重阻碍了其致病机制的深入研究。为了实现在宿主中的长期存在，支原体必须有效地逃避宿主的免疫系统，在支原体的基因组中常含有可变基因家族，用于编码人容量可变抗原库从而使得菌体表面的抗原性发生变化l，0J，JoM.hyo

6、rhinis•I•发现的可变蛋白被称为可变脂蛋白(variablelipoprotein,vlp)家族tl2-14]o目前共发现有7个成员,即vlpA^vlpB、vlpCxvlpD、vlpE^vlpF>vlpGoM.hyorhinis可同时表达一种或多种vlp,同时每个vlp成员内部含有数冃可变重复区，其可通过插入或缺失基因片段改变重复次数，从而使整个分了的长度发生变化。通过这两种表达变异，帮助支原体改变表面抗原性，逃避宿主免疫系统。在前期研究中已经发现了vlp具有黏附细胞功能，木试验主要针对vlp7个成员之一vlpA的黏附功能进行具休研究，包括黏附能力检测、黏附功能区域鉴定、数

7、目可变垂复区即III区的片段重复次数对vlpA黏附能力的影响研究。1材料方法1・1主要实验材料1.1.1材料与试剂质粒pET・32a(+)由江苏省农业科学院兽医所保存；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。PCR各种试剂、T4DNA连接酶、DNA和蛋白质分子量标准、X肋I和HindIII均购STaKaRa公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成；HRP■羊抗兔IgG、FITC■羊抗兔IgG购自武汉博丄•德公司；兔抗硫氧还蛋白多抗购自武汉三鹰牛物技术有限