高效液相色谱仪

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1、第一部分高效液相色谱仪及简单操作维护HPLC技术的发展过程HPLC是经典液相色谱的发展，同时是气相色谱理论的扩展和延伸。二十世纪60年代末期生产出商品化液相色谱仪，其发展非常快速，经过30多年的努力已成为分离学科中的骨干技术。目前，HPLC技术已趋于成熟。特点：采用高压泵、高效填料、高灵敏度检测器实现了快速、高效和操作自动化。HPLC和经典液相色谱法的比较高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱柱长/cm10～2510～200色谱柱柱内径/mm2～10（不锈钢管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒径μm）3～5075～

2、600流动相流动方式高压输液泵压入靠重力流入溶液的传质、扩散速度快缓慢色谱柱入口压力/MPa2～200.001～0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2*103～5*1042～50进样量/（g）10-6～10-21～10分析时间/h0.05～1.01～20高效液相色谱法的特点（1）分离效能高：柱效可达5000~30000块/米（2）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程的选择性（3）检测灵敏度高：UV—最小检出量可以达到10-9gFD--最小检出量可以达到10-12g（4）分析速度快:采用了高压泵流动相和储液罐（

3、1）储液罐材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）棕色玻璃瓶会避免藻类的生长容积：0.5~2.0L放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差注意：密封、过滤（2）流动相----使用限制避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂：碱金属卤化物及其酸溶液，如：碘化锂、氯化钾等高浓度无机酸，如硝酸、硫酸.可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物含强络合剂的溶液，如EDTA，乙二胺四乙酸四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液（2）流动相----

4、过滤流动相过滤的目的过滤去除可能存在的微小固体颗粒保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法在线溶剂过滤抽真空过滤流动相在线过滤：清洁方法：1、用水冲洗残留溶剂后，将过滤器放在约35％浓硝酸里浸一小时2、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器3、将过滤器重新装好。4、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（每1～3个月至少清洗一次）不能用超声波清洗流动相抽真空过滤过滤用膜：水系和有机，孔径：0.22µm和0.45µm流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的

5、尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化（2）流动相----脱气常用的脱气方法有：抽真空脱气法：特点：可以一次完成过滤和脱气任务注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系超声波脱气法简单，但效果不理想常用的脱气方法（续）在线真空脱气法流动相的要求：(1)使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，最好每天更换流动相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreeho

6、ursc:aftereighthours流动相的要求：(2)互溶性流动相的要求：(3)紫外吸收甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm乙腈和水@254nm流动相的要求：(4)pH的影响高压输液泵和梯度洗脱装置性能：①泵体材料耐化学腐蚀②能在高压下连续工作③输液流量范围宽对填充柱：分析型输出流量为0.1~10ml/min制备型输出流量为1~100ml/min对微孔柱：分析型输出流量为10~1000μl/min制备型输出流量为1~9900μl/min④输出流量稳定、重复性高流量控制的精密度应小于1

7、%（最好为0.5%），重复性最好为0.5%高压泵的分类往复型泵目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵双柱塞往复式串联泵示意图输液系统的辅助设备主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置梯度洗脱装置梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类四元低压梯度系统四元高压梯度系统泵操作注意事项设定泵运转时的高、低压极限2.缓冲盐溶液与有机溶剂转换

8、时必须用去离子水清洗泵3.缓冲盐溶液的浓度不能过高，pH范围1～13，Cl-的浓度小于0.1mol/L4.清洗柱塞注意事项：1、必须设定高、低压极限2、缓冲溶液与有机溶剂转换时用去离子水清洗泵3、缓冲盐溶液的浓度不能过高，pH范围1～13，Cl-的浓度小于0.1mol/L；经常使用，每周至少更换一～二次（95%的水）很少使用则每次使用前必须更换泵压力不正常的主要原因：