DNA重组和基因转移

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1、第七章DNA重组和基因转移第一节目的基因与载体的连接一、粘末端DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切质粒载体的定向重组二、平末端DNA片段的连接1、直

2、接用T4连接酶连接2、同聚物加尾法3、衔接物连接法衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接4、DNA接头连接法接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端，先利用齐平末端连接方法将它与平端的外源DNA连接起来，造成人工粘性末端，即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接。所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘

3、性末端。1、按照平末端连接方法加上接头。2、将凹端变为平端（1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子3、使用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平3′凹端转变成粘端。TCGAAGCTGATCCTAG载体经xhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分补平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA这样，就可以实现有效重组。3′3′3′3′5′5′5′5′四、cDNA与载体的连

4、接通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆第二节重组DNA分子的筛选与鉴定外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：（1）（2）（3）转化E.coli一、遗传检测法（一）根据载体表型特征选择重组体分子1、抗药性标记插入失活筛选法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因内部，tetr抗性消失，表型为不抗四环素（tets）、而仍抗氨苄青霉素（ampr），这样的转化细胞在含有amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有

5、重组DNA分子的转化细胞在含有tet的培养基平板上生长，在含有amp的培养基不能生长。插入失活法筛选重组子2、α—互补例；pUC质粒在LacZ—的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α—互补，菌落呈蓝色。如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。（二）根据插入序列的表型特征选择重组体进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果

6、在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。二、物理检测法1、凝胶电泳检测法2、R-环法在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，即所谓的R-环条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA和DNA的混合物置于这种条件下，RNA便会同双链DNA分子中与之互补的序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而另一条DNA链则成为单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“

7、泡状”体，叫做R-环结构。三、核酸杂交检测法例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑)四、免疫化学检测法免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种。转化菌落影印平板置于含氯仿饱合气体的容器细菌裂解，抗原释放覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜形成抗原抗体复合物将NC膜与I125标记的抗体温育放射自显影与母板对照，挑取所需的重组克隆标记抗体测定法的步骤：用

8、免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因五、DNA-蛋白质筛选法六、转译筛选法原理：外源DNA蛋白质翻译能与某一特定DNA序列结合作为探针与克隆群体杂交转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法。1．杂交抑制转译要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA。DNA蛋白质mRNA蛋白质×杂交原理：步骤：转化菌落提取重组DNA与mRNA总杂交形成DNA-RNA杂种分子将总mRNA（