第16章+血液生化-镰状红细胞贫血

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1、镰状红细胞贫血症血红蛋白的结构和功能镰变过程电泳检查★血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。★分子结构：每一血红蛋白分子由一分子的珠蛋白和四分子亚铁血红素组成，珠蛋白约占96％，血红素占4％。★人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。★珠蛋白合成异常包括珠蛋白肽链量的不正常和肽链分子结构的异常。前者引起地中海贫血，后者导致异常血红蛋白病，是一组遗传性疾病。分子病理镰变疏水的缬氨酸取代带有电

2、荷的谷氨酸改变血红蛋白分子外形和电荷低氧张力和低PHHbS液晶多聚体继续聚合成丝状体缆样结构（排列方向与细胞膜平行并与细胞膜紧密接触）红细胞细长而扭曲双凹圆盘状变成新月状1949年，Panling等用电泳技术发现了镰形红细胞内的HbS,并得出血红蛋白异常是在其分子的蛋白质部分，从此创立了“分子病”的概念，即由于遗传突变引起蛋白质结构异常而导致的疾病。这促进了疾病分子生物学的研究，镰形红细胞贫血症成为了世界上发现的第一个分子疾病。5.常用技术--电泳1.电泳的概念2.电泳迁移率3.电泳应用的广泛性

3、4.电泳迁移率与DNA电泳的概念1.带电颗粒在电场中的定向运动称为电泳2.开展电泳的必要条件⑴外加电场（电泳仪）⑵样品中颗粒带电（缓冲液）⑶支持介质（聚丙烯酰胺凝）⑷适宜的条件组合电泳迁移率1.带电颗粒在单位电场强度下的移动速度称为电泳迁移率2.影响电泳迁移率的主要因数有Q:颗粒所带电荷r:颗粒的性质（半径，构型与构象）η:介质的黏度支持介质等等3.M=Q/6πrη电泳应用的广泛性电泳是最为重要和应用最为广的生物化学和分子生物学技术之一，可以毫不夸张地说没有不应用电泳技术的基因诊断，也没有不应用

4、电泳技术的分子生物学和基因工程。电泳迁移率与DNA1.在一般的聚丙烯凝胶电泳中，双链的电泳迁移率与其链长呈反相关，据此建立了PCR-RFLP技术。2.在一般的聚丙烯凝胶电泳中，单链的电泳迁移率不仅与其链长有关，更与其构象有关，而构象则与其一级结构有关，据此建立了PCR-SSCP技术。扩增血红蛋白特定基因片段1.利用特异性的引物扩增编码血红蛋白β链含有GAA→GTA突变部位的DNA片段。2.扩增既含有特定的突变部位又能存在具有鉴别性内切酶的DNA片段是开展PCR-RFLP的关键。3.当含有突变的部

5、位目前尚不能发现有可用的限制性内切酶时，可以考虑引入错配碱基的方法导入内切酶识别序列。MstⅡ酶切识别位点:↓----CCTNAGG--------GGANTCC----↑(Glu)----GGAATCC---GAA,GAG↑(Val)----GGTATCC---GUA,GUG†扩增片段的酶切(A)MstⅡ酶切识别位点:↓----CCTNAGG--------GGANTCC----↑HbA↓----CCTTAGG--------GGAATCC----GAA,GAG(Glu)↑HbS----CCA

6、TAGG--------GGTATCC----GUA,GUG(Val)扩增片段的酶切(B)HbA-----CCTTAGG---------∥---------------------CCTTAGG------CCTTAGG------GGAATCC---------∥---------------------GGAATCC------GGAATCC--------∣---------∥-------1.15kbp-------------------∣-----0.2kbp-----∣HbS--

7、---CCTTAGG---------∥--------------------CCATAGG----CCTTAGG--------GGAATCC---------∥---------------------GGTATCC-----GGAATCC--------∣----------------------------∥-------1.35kbp-----------------------∣HbA↓------CCTTAGG-----------GGAATCC-----↑Hbs------C

8、CATAGG-----------GGTATCC-----氧解离曲线氧解离曲线是表示氧分压与Hb氧饱和度关系的曲线。曲线近似“S”形，可分为上、中、下三段。（1）氧解离曲线的上段，曲线较平坦，相当于Po2由13.3kPa（100mmHg），变化到8.0kPa（60mmHg）时，说明在这段期间Po2的变化对Hb氧饱和度影响不大，只要Po2不低于8.0kPa（60mmHg），Hb氧饱和度仍能保持在90%以上，血液仍有较高的载氧能力，不致发生明显的低氧血症。（2）氧解离曲线的中段，该段曲线较陡，是H