生物中心法则

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1、PCR基础生物中心法则转录翻译逆转录DNARNA蛋白质5’AATCCGGACCT3’3’TTAGGCCTGGA5’‖‖‖〣〣〣〣‖〣〣‖DNA组成DNA体内复制dsDNAssDNA解链酶/拓扑异构酶DNA聚合酶/引物/dNTPsPCR---DNA体外复制PCR——信号放大PCR的特点高灵敏度高特异性简便快捷PCR扩增体系模板——3’TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA5’引物——5’ATCCGGAC耐热DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTPMg2+酶活化因子底物逆转录体系RNA模板——3’UUAG

2、GCCUGGAUAAGCGCCUGGA5’引物——5’ATCCGGAC逆转录酶dATPdGTPdCTPdTTPMn2+酶活性依赖金属离子底物PCR检测病原体裂解DNA释放PCR扩增耐热DNA聚合酶引物dNTPs二价金属离子DNA聚合酶病原体裂解RNA释放cDNAPCR扩增逆转录酶耐热DNA聚合酶RT-PCR扩增引物dNTPs二价金属离子DNA聚合酶引物dNTPs二价金属离子逆转录酶RT-PCR过程逆转录酶/耐热DNA聚合酶PCR结果假阳性？原因：扩增产物的污染和非特异性扩增产物。解决方案：UNG防污染分区实验严格

3、规范的操作避免PCR后处理杂交探针UNG高温UNGUNG作用机制实验室分区设置PCR前试剂准备区PCR前样本处理区加样区PCR扩增检测区注意事项:操作流程严格执行单方向走动;每一扩增前区的仪器和设备必须专用;扩增后区的设备只能在扩增后区使用;用带滤芯的Tip头吸取样本/核酸/扩增产物;阴性对照应被视为具潜在感染性;带一次性无粉手套,穿实验工作服;操作台必须预先用0.5%sodiumhypochlorite和70%ethanol消毒。PCR产物检测凝胶电泳——EB（溴化乙锭）可镶嵌在DNA片段中，并在一定波长的紫外

4、线照射下发射出橘红色的可见光。在凝胶介质中不同大小的PCR片段在一定电压下的迁移率不同，从而在凝胶中呈现出不同位置上的小亮线。问题：肉眼判断，受人为因素影响。紫外线和EB对人体有害。灵敏度受限。容易形成PCR产物污染，造成假阳性结果。PCR相关诊断试剂必须采用探针筛选。PCR产物检测PCR-ELISA——PCR产物通过探针筛选后，采用酶联免疫法进行检测。优势：探针筛选PCR产物，特异性提高。ELISA信号再次放大，灵敏度高。问题：PCR产物后处理容易造成污染，最终造成假阳性结果。定量范围窄，需做样品稀释。操作繁琐

5、。PCR产物检测荧光PCR——反应体系中PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化。)全封闭反应，无需PCR后处理)特异性强，灵敏度高)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确)定量范围宽，可达到10个数量级)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断)可实现一管双检或多检)操作安全，缩短时间，提高效率)利于自动化和联网管理PCR假阴性？假阴性结果通常是DNA/RNA模板降解、操作不当造成丢失、抑制物的存在、试剂本身的检测限度。解决方案：规范样本的采集和保存严格PCR前后

6、操作内对照选用高灵敏度的试剂RNase污染RNA极易受RNase降解，造成PCR假阴性结果。解决办法：预防创造无RNase的环境全部采用一次性耗材，使用前高温灭菌；或全部采用DNase/RNasefree的一次性耗材。配制的相关试剂均进行DEPC处理和高温灭菌。使用前均于低温保存。强变性剂裂解处理。规范操作低温操作。佩戴手套、口罩、帽子、工作服，手套勤更换。内标工作原理图