氨基酸的分析分离

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1、氨基酸的分析分离为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进行分析和分离工作。其方法较多，而目前使用较多的是层析法。（1）分配层析的一般原理：所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相（stationaryphase），一个为流动相或动相（mobilephase）。混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（partitionordistributioncoefficient）来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）。用下式

2、表示：CA←表示某一物质在动相中的浓度Kd=———CB←表示某一物质在静相中的浓度物质分配不仅可以在互不相溶的两种溶剂即液相-液相系统中进行，也可在固相-液相或气相-液相间发生。其系统中的静相可以是固相、液相或固-液混合相（半液体相）；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。在实际层析时，其层析行为一般并不直接决定于它的分配系数，而是取决于有效分配系数Keffo：某一物质在A相中的总量Keffo=—————————————某一物质在B相中的总量对液相-液相层析系统来说：CA·VAKeffo=———=Kd·RVCB·VB这里，CA和CB的意义同前；VA和VB分别为A相B相

3、的体积；RV为A、B两相的体积比。由此可见，Keffo是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。利用层析法分离混合氨基酸，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。若是逆流分溶或逆流分配，当转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的分数含量是（p+q)n=1展开式的相应项的值。这里p和q分别为某一物质在静相和动相中的分数含量，即p+q=1。例如物质Y的Kd=q(动相)/(静相)p=1即:p+q=1/2+1/2=1转移n次后,在第k号管中某一物质的含量可由下式计算:n！·pn-k+1·qk-1Tn,k=————————

4、———（n-k+1）！·（k-1）！怎么办？例题：当某一物质在一个层析系统中的分配系数为3时，物质被转移4次后在第四管中的含量是多少？解：根据分配系数公式可知：p+q=1/4+3/4=1，即在静相中的分数含量为1/4，在动相中的分数含量3/4，则可由上述公式计算如下：4！·1/4·（3/4)3T4,4=—————————=27/643！假若该物质的总量为96，则该管中的含量应为：（27/64）·96=40.56461813123641216486481616161632329271688816逆流分溶原理分配系数为1分配系数为3上相为动相（A），下相为静相（B）246810121416管

5、号302010Kd=1Kd=3管中物质的总量分溶曲线结论：分配系数大的物质沿一系列分溶管的移动速度快与分配系数小的物质n=600n=100n=10相对浓度溶剂系统体积分溶曲线与转移次数（理论板数）的依赖关系(2)分配柱层析层析柱中的填充剂或支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充剂构成的柱床可以设想为由无数的连续的板层组成，每一板层起着微观的“分溶管”作用。当用洗脱剂洗脱时，在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系数进行连续不断的进行分配移动。分部收

6、集层析柱下端的洗脱液，然后分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。加洗脱剂氨基酸样品支持剂层析柱分部收集1.00.50.1光吸收值20406080100120流出液（毫升）（3）滤纸层析滤纸层析也是分配层析的一种。这里的滤纸纤维素吸附水作为固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种溶剂系统进行第二相展层。由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具

7、有不同的迁移率（Rf），因此它们就会彼此分开，当用茚三酮显色时，就会在滤纸上面出现各种氨基酸的斑点。当然，若氨基酸种类较少或一相就能分开，进行一相层析即可。溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点XY滤纸层析中的Rf值，Rf=X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的双向滤纸层析图谱（4）薄层层析（thin-layerchromatography)：该层析分辨率高，需量极少，层析速度快，可使用的支持剂种类多，如纤维素粉、硅胶、氧化铝等。其步骤大体如下