多糖结构分析

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1、实验八多糖结构分析多糖在朱物学上的重要意义，尤具是在医药学上的重耍意义决定了多糖研究的迅速发展，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但山于多糖结构的复朵性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,木实验选择天然多糖(半乳葡萄廿露聚糖)作为实验材料,对其一级结构做初步的分析。多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。【实验目的】1•了解多糖结构分析的内容及方法。2.了解多糖一级结构分析的革木原理。3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。一、糖含量测定【实验原

2、理】苯酚一硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。【实验材料】1.实验器材721型分光光度计。2.实验试剂(1)98%的浓硫酸。(2)80%苯酚：80g苯酚加20ml水使之溶解，可置冰箱屮避光长期贮存。(3)6%苯酚：临用前用80%苯酚配制。(4)标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml)：HZlOOmg葡萄糖，用蒸憎水溶解，定容至1L。(5)多糖样品：半乳葡萄甘霜聚糖溶液(0.1mg/ml)。【实验操作】1.制作标准曲线：取9支T燥试管，按下表操作管号012345678标准溶液(ml)00.40.60.81.01.

3、21.41.61.8蒸饰水(ml)2.01.61.41.21.00.80.60.40.26%苯酚(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸(ml)555555555静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟A490横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。1.样品含量测定：収样品液1.0ml,按上述步骤操作，测光密度。3・计算：糖含量（%）=C/（CoxV）X100%C:由标准曲线查得的糖微克数C（）：样品溶液的浓度（0」mg/ml）V：测定时用的样品溶液体积（1.0ml）二、单糖组成分析【实验原理】多糖在浓硫酸屮保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸

4、层析分离，特定试剂显色后与己知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物小单糖的组成。【实验材料】1.实验器材水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。2.实验试剂（1）标准糖溶液：称取一定量的半乳糖、葡萄糖、廿露糖、阿拉们糖，用蒸係水溶解，得标准糖混合溶液（每种糖的点样量为20微克〜30微克）。（2）展层剂：正丁醇：乙酸：水=4：1：5（上层）。（3）显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正「醇饱和水溶液（邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100ml,加苯胺0.93g（相当于0.9ml）。（4）BaCO3；1mol/L硫酸。【实验操作】1.完全酸水解：称取20mg多糖样品,加入lmoVL

5、H2S042ml;封管，100°C水解8小时,然后加入BaCO3屮和，定罐滤纸过滤，滤液留作分析。2・纸层析：将层析滤纸剪成7cmx40cm的纸条，距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线，在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。川玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位直再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层吋间约为36小时。3.显色：将滤纸4X111,自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100°C条件下15分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上山下而上的顺序是：半乳糖-匍萄糖-片露糖-阿拉们糖。与标

6、准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。三、糖链的序列测定（-）高碘酸氧化【实验原理】高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子屮连二释基或连三為基处，牛成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行,每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定髙碘酸消耗量及「卩酸的释放虽，可以判断多糖分子中糖昔键的位置、类型、多糖的分枝数冃和取代情况等。【实验材料】1.实验器材紫外分光光度计。2.实验试剂⑴浪甲酚蓝指示剂：0.1克滉甲酚蓝溶于250ml蒸馆水中(含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠)。⑵30mmol/L高碘酸钠溶液。(3)乙二醇。(4)0.01mol/La氧化钠溶液。【实验操作

7、】1.制作标准曲线：取6支干燥试管，按下表操作管号012345高碘酸钠(ml)00.51.01.52.04.0蒸馆水(ml)4.03.53.02.52.00各取0.1ml,定容至25ml,在223nm处测定光密度A223横坐标为肓碘酸钠亳摩尔数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2.样品测定称取多糖样品25mg,用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml,置于暗处，室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48…小时间隔取样0.1ml,蒸馆水稀释250倍后，使