细胞培养原代培养传代培养

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1、器械的清洗2011.10.11为何要进行清洗？离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，这些物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。除一次性用品外，玻璃、塑料、橡胶和金属质地等其他培养用品，无论新旧，使用前均需彻底清洗。ExperimentofCellEngineering玻璃器皿的清洗刷洗浸泡浸酸冲洗Ⅰ玻璃器皿的清洗1主要包含有：培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。2清洗步骤：泡在含有洗洁净的自来水中→捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25遍→过一遍一蒸水→烘干→泡入铬酸过夜→从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍→过三

2、遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子备用→用前高温灭菌（121℃，25min）→烘干→使用注意：1、新的玻璃器具先要泡过夜，然后清洗步骤与上面相同。2、移液管用含洗洁精的自来水超声3次，每次半小时。清洗标准：玻璃透亮，内外壁水膜均匀、无油迹，无任何残留物质。Ⅱ塑料、橡胶类器皿的清洗1塑料类器皿主要包括：孔板、大枪头、瓶盖、滤器、超声管、注射器等。2橡胶类器皿主要包括：乳胶头、橡胶头、胶塞、胶垫等。2清洗步骤：泡在有洗洁净的自来水中→用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25次以上→过一遍一蒸水→泡入盐酸过夜→从酸中捞出后自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水，

3、三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前高温灭菌（121℃，20min）→烘干→使用注意:乳胶类器材由于常有滑石粉类成分，故应先用流水充分清洗。目录细胞培养基本概念细胞培养基本要求细胞培养基本技术细胞培养定义定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织

4、、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。细胞培养的基本概念传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。接触抑制（Contactinhibition）细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3

5、年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。细胞传代次数（PassageNumber）原代培养（primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖细胞株（cell

6、 strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。原代培养与细胞系原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA细胞系资源有限细胞系，无限细胞系细胞系cellline细胞株cellstrain培养细胞的特性

7、培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再