VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响

《VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响田小飞陕西省肿瘤医院妇瘤中心研究背景宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。WHO报道：全世界发病人数为45万，我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预后的重要因素。（曹泽毅主编，中华妇产科学，2004）肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其复杂的过程。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现，淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又一热点，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善

2、患者的预后。目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在VEGF-C特异性与受体VEGFR-3结合，诱导淋巴管生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。血管内皮生长因子-C(vascularendothelialgrowthgrowthfactor-C,VEGF-C)是新近发现的VEGF家族的新成员，是特异性淋巴管生长因子。在近50％的人类恶性肿瘤中表达。VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，主要表达于正常组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及人的肿瘤细胞。（M.A.AAl-Rawi.etal.HistologyandHistopathology2005）(MarcG.Achenetal.Can

3、cerCell.2005.)研究设想VEGF-C淋巴内皮细胞肿瘤细胞?肿瘤淋巴转移实验方法体外培养Hela细胞脂质体介导寡核苷酸转染24h、48h、72h荧光定量RT-PCR检测VEGF-CmRNAMTT法检测细胞生长间接免疫荧光染色和流式细胞术检测VEGF-C蛋白黏附实验Tanswell小室侵袭实验材料1．细胞株人宫颈癌细胞株Hela由四川大学华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。2．主要试剂及其配制兔抗人VEGF-C多克隆抗体（北京中山金桥生物有限公司）标记FITC羊抗兔二抗（北京中山生物技术有限公司）Matrigel(美国CollaborativeResearch公司)EC

4、M胶（extracellularmatrix）E1270(美国Sigma公司)纤维粘连蛋白FN（Roche公司）VEGF-C寡核苷酸：（由北京赛百盛生物技术公司合成）反义链5’-GCCAGCCTCCTTTCCTTAGC-3’，两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸251～271，在5’端标记FAM，正义链5’-GCTAAGGAAAGGAGGCTGGC-3’，两端各3个碱基进行硫代修饰。阳离子脂质体Lipofectamine™2000（美国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠）Transwell小室（3428型，孔径8um，美国Corning-Costar公司）引物：

5、VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司合成，其氨基酸序列及其产物长度如下：基因名称核苷酸序列产物长度VEGF-C上游引物5’-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-393bp下游引物5’-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3’Taqman探针5’-FAMTGCCTCTCTCTCAAGGCCCCA-TAMRA-3’GAPDH上游引物5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’141bp下游引物5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’Taqman探针5’-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3实验

6、仪器FTC2000荧光定量基因扩增仪MSEMicro-CentaurCentrifuge微型台式离心机水平电泳仪（美国BIO-RAD公司）GelDoc1000凝胶成像系统微量移液器（法国Gilson公司）EliteEsp型流式细胞仪VEGF-C反义寡核苷酸的设计反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书馆的GENEBANK数据库中，查找到人VEGF-C的基因序列（NM005429）。根据设计原则：长度在15～20bp、修饰；G+C的比例：40%－60%；避免4个碱基以上自身反向互补序列；避免4G堆积；避免六个以上的回文结构等。设计反义链：5’-GCCAGCCTCCTTTCCTT

7、AGC-3’；正义链：5’-GCTAAGGAAAGGAGGCTGGC-3’，为提高对核酶的抗性，在两条链的两端各3个碱基硫代修饰。确定序列后，常规进行人类基因组同源性分析，即：通过Blast分析，证实两条链与人类其他以已知基因无同源性。为便于观察寡核苷酸转入细胞的效率，在反义链5‘端标记了羧基荧光素(FAM)，FAM的激发波长是480nm，发射波长是520nm，在荧光显微镜下是绿色的。MTT法检测Hela细胞黏附能力的变化包被基底膜接种细胞MTT比色法检测黏附率＝（OD值实验组－OD值BSA组）/OD值BSA组×1