真菌检测方法

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1、分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中

2、的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长

3、,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)

4、上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。　　由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培

5、养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。2　接种方式　　接种

6、方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现,对霉菌计数来说,涂抹法有以下几方面优越于倾注法:①培养出的霉菌菌落数较多;②培养所需的时间较短;③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全,便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的,在培养基表面生长快,发育好,而混在培养基中发育就受影响,而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。我们在自己的实验室也做了类似的比较试验,通过对30种常见霉菌的试验证实了上述

7、的结论。因此,我们认为,霉菌计数采用涂布法既准确又省时,值得推广。　　3　培养温度　　经对多种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现,大部分菌种的最适温度为25~30℃。但一些产曲霉毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度,如黄曲霉35℃、构巢曲霉33℃、烟曲霉37℃、小孢子菌35℃。因此,培养温度也应根据培养目的而定,一般情况下都采用25~28℃培养,若有特殊培养目的,则应适当调节培养温度。4　培养时间　　我们对30种常见霉菌的生长速度作了调查,正常培养条件下,培养3~4天的菌落数与5~7天的基本相同,但菌种的特征不明显

8、,因此,如果只要作霉菌计数,培养3~4天已基本达到目的,但如果还要进一步分类鉴定,则需要培养更长的时间(7~14天)。必须特别注意的是,有几类生长特别快、菌丝很多的菌,则必需在48小时以内计数,否则菌丝就会覆盖整个平皿,无法准确计数。这类菌主要有:毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较大的样品,这类菌污染较多,检测这类样品,应提早观察记录。5