2015版中国药细菌内毒素检查法验证方案

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1、记录编码：LZ-B00-TJL-2011-010-A序号：北京灵泽医药技术开发有限公司一次性肠外营养输液袋内细菌毒素检查法验证方案编制：李树权日期：2012.11.7审核：日期：批准：日期：1.验证目的为公司产品细菌内毒素检测方法提供依据。2.验证依据3.《中华人民共和国药典》2010年版第二部附录ⅪE细菌内毒素检查法4.验证条件无菌操作间（万级）5.验证准备4.1试验设备设备名称设备编号设备状态内毒素检测仪A10-2012-A-004-0完好鼓风式干燥箱A10-2010-A-007-1完好5.2试剂试剂名称来源批号内毒素工作品（10EU/ml）湛江博康海洋生物1107010鲎试剂(0.2

2、5EU/ml)湛江博康海洋生物1206110内毒素检查用水湛江博康海洋生物1204065.3样品：样品名称规格型号批号数量一次性肠外营养输液袋PN-E-W3500ml24.4实验前准备：1)实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、耐热器皿须经180℃烘烤120min。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。2)使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，置30%双氧水中浸泡4小时，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后60℃

3、烘干备用。或用一次性无热源吸头。5.样品制备（供试液溶液）将20ml内毒素检查用水注入到一次性肠外营养输液袋内，37℃孵育60min。作为供试品溶液。6.鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。6.1实验操作6.1.1细菌内毒素标准溶液的制备：1)取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内；

4、2)按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程请参见标准品使用说明书）。6.1.2待复核鲎试剂的准备：取规格为0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用。每支加入0.1mL检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1mL/支时，取若干支按其

5、标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1mL分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。6.1.3加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），每支分别加入0.1mL2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；1列2支（管），每支分别加入0.1mL检查用水。6.1.4加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入（37±1）℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(60±2)min。6.1.5观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将

6、每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。6.1.6实验结果计算如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）：λc=antilg(∑X/4)；式中X为反应终点浓度的对数值（lg）,反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。6.1.7结果判断当λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和

7、2.0λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。内毒素浓度（EU/mL）编号0.50.250.1250.0625NC反应终点浓度12347.内毒素干扰试验7.1试验溶液配置：编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液——————2B2入/供试品溶液供试品溶液12482入（0.5EU/ml）1入（0.2