分子生物学常用技术4DNA测序和基因芯

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1、分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交技术PCR技术DNA物理图谱DNA序列测定生物芯片“基因靶向”技术RNA干扰技术核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前常用的两种序列测定技术是：Sanger等（1977年）：双脱氧链终止法Maxam和Gilbert（1977年）：化学降解法其中双脱氧链终止法是目前应用最多，易自动化。DNA序列测定BAC算法:建立BAC文库：把基因组打碎成200－300kb的片段，并制成BAC文库，再选择一些BAC进一步打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。

2、WGS:全称为whole-genomeshotgun，基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。并且，WGS在现在的测序项目中使用得越来越广泛。例如水稻基因的测序，就是使用的WGS策略。DNA测序策略F.FrederickSanger(1918～)剑桥大学教授。1943年以研究赖氨酸的课题获博士学位1955年测定了胰岛素的一级结构获1958年诺贝尔化学奖。Sanger经过多年的研究，找到一种试剂，名为2，4－二硝基氟化苯（桑格试剂），经10年的努力，测定出胰岛素两条肽链分别含21个和30个氨基酸的排

3、列顺序和位置，60年代后，Sanger的工作转向核酸方面，正确地确定了RNA和DNA中核苷酸的排列顺序。Sanger因设计出一种测定DNA内核苷酸排列顺序的方法而与W.吉尔伯特共获1980年诺贝尔化学奖。即双脱氧法测序（DNA自动测序仪以本原理设计）1982年FrederickSanger退休Sanger研究所和德国的EpigenomicsAG公司将联手进行人类外基因组计划(HumanEpigenomeProject)。Sanger双脱氧链终止法原理待测单链DNA作为模板引物四种dNTP(其中一种用32P/3

4、5S标记)终止剂(ddNTP)DNA聚合酶分别得到ddAddTddGddC结尾的片段一、Sanger双脱氧链终止法原理通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键

5、。存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱,将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3'端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全

6、部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。ddATPddCTPddGTPddTTP全自动测序技术以Sanger测序法为基础二.测序过程:1.模板制备:克隆DNA,PCR产物,细菌克隆,genomicDNA2.引物设计:通用primerm13,T7,sp6etal;specificprimer3.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入DNA聚合酶dNTP标记底物终止剂不同ddATPddGT

7、PddCTPddTTP标记4种荧光四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链4.电泳ACGT次序高压电泳5.显影得到直读图象ABIPRISM310全自动测序仪全自动测序结果人类基因组计划的概述1986年，美国生物学家、诺贝尔奖获得者RenatoDulbecco在“Science”上首次提出人类基因组计划的设想，并建议组织国家级和国际级的项目进行研究.1990年10月由美国国会批准正式启动ＨＧＰ研究1999年9月中国继美、英、日、德、法之后第六个国际人类基因组计划参与国，负责测定的区域位于3号染色体短

8、臂上，占人类整个基因组的1%“人类基因组计划”、“曼哈顿”原子弹计划、“阿波罗”登月计划，并称为自然科学史上的“三大计划”人类基因组研究的策略（1）建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC200－1000kb）克隆群。几十到几百kb的细菌人工染色体克隆（BAC）　　（2）利用DNA标志或者DNA指纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连