免疫组化操作规程

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1、免疫组化操作规程一仪器设备118cm不锈钢高压锅和电炉2医用微波炉3水浴箱;4冰箱-18-45湿盒6耐高温塑料切片架7可调微量移液器8定时器9pH计二试剂1PBS(磷酸盐缓冲液pH7.27.4)NaCl137mmol/LKCl2.7mmol/LNa2HPO44.3mmol/LKH2PO41.4mmol/L2柠檬酸盐缓冲液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制柠檬酸三钠3g柠檬酸0.4g3酶消化液a0.1%胰蛋白酶液用0.1%CaCl2(pH7.8)配制b0.4%胃蛋白酶液用0.1N的HCl配制三操作流程1脱

2、蜡和水化脱蜡前将组织芯片放在60恒温箱中烘烤30分钟1置于二甲苯I中浸泡10分钟在二甲苯II中再浸泡10分钟2无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟395%乙醇中浸泡5分钟485%乙醇中浸泡5分钟570%乙醇中浸泡5分钟6蒸馏水中浸泡5分钟2抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片1抗原热修复A高温高压热修复取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离

3、开热源冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟B微波热修复取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中中高档继续处理10-15分钟取出微波盒冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟C酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液胰蛋白酶使用前预热至37切片也预热至37消化时间约为5~30分钟胃蛋白酶消化37时间为10-30分钟3免疫组织化学染色SP法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的

4、3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次4抗原修复5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟7甩去多余液体滴加抗371小时或者4过夜4过夜后在37复温45分钟8PBS洗2次各5分钟9滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒10PBS洗2次各5分钟11滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次各5分钟13DAB显色510分钟在显微镜下掌握染色程度14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化15脱水透明封片镜检SABC法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭510分钟蒸馏

5、水洗1次4抗原修复5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液室温10-20分钟甩去多余液体7滴加抗,371小时或者4过夜4过夜后在37复温30分钟8PBS洗2次每次5分钟9滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒10PBC洗2次每次5分钟11滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次每次5分钟13DAB显色DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色镜下掌握显色程度14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化15脱水透明封片镜检上海闪晶分子生物科技有限公司地址：上海市宜山路705号B座18楼邮编：200233联系：市场部

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