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1、拟南芥突变体的相关研究遗传学摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析1拟南芥突变体的筛选拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理
2、论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。1.1植物材料诱变以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V/V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃
3、下春化3天后种植。1.2诱变植株培养将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。1.3突变体的筛选拟南芥种子用0.5%（v/v）次氯酸钠加0.1%（v/v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培
4、养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/m2s-1。在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再转入含0.65%琼脂（W/V）的MS培养基中，根尖朝下培养一周左右；然后转入含有蛭石的营养土中培养，以收获M3代种子。M3代种子再进行上述低钾条件下的根弯曲试验。若某一株系的M3代幼苗仍表现耐低钾性状，则将其确定为耐低钾突变体。2拟南芥突变体的遗传分析M3代突变体种子种于MS盐培养基上,幼苗生长5~6d后将其移栽于蛭石上，培养至开花，以野生型为父本，突变体为母本,进行杂交,得F1代。杂交试验操作程序为：（1）选择母本花。即
5、在ros植株主花轴顶端的花序中选择花瓣刚从花萼顶端露出的幼小的花,小心剥去其花萼,花瓣和雄蕊。(2)选择父本花。选择完全开放的花,花瓣与主花轴几乎垂直,花药正处于释放花粉时期,其表面呈颗粒状。(3)授粉。用镊子从父本植株取下花药,授粉到准备好的母本植株柱头上,授粉3~7d后,如果杂交成功的话,肉眼即可看到角果生成,而杂交不成功的柱头因未授粉而萎蔫。(4)统计结果。将F1种子种于MS培养基上,生长5~6采用根弯曲法检测植株对H2O2抗性表现,统计结果用于遗传分析。(5)结果分析选ros突变株进行自交和杂交,检测F1和F2对H2O2抗性。结果发现,杂交成功
6、的F1用10-4mol/L的H2O2处理幼苗,全部不抗H2O2,即根的生长受到抑制。而在F2代,不抗与抗呈现3B1的比例分离。突变体发生了隐性单基因突变。3拟南芥的群体遗传变异研究拟南芥是一种自花授粉物种，在自然界存在的大多数为自交系。且几乎都是纯合子，拟南芥的群体遗传变异已被广泛研究。它的表型和分子特征可以从种子开始分析，包括形态特征、同工酶标记位点(isozymemarkers)、微卫星(microsatellites)、限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)、切割扩增多型性序列
7、(CleavedAmplifiedPolymorphicSequence,CAPS)标记,扩增片段长度多态性(AmplicationFragmentLengthPolymorphismAnalysis,AFLP)标记和大规模DNA测序。而多数研究集中在单拷贝核序列的多态现象。此外，拟南芥重复序列和基因家族也已被分析。包括线粒体DNA(mtDNA)、着丝点重复序列和转座子。从所有的研究中可以得知，由于是自花授粉植物，拟南芥的群体多态性是有限的。不过，利用AFLP、CAPS和微卫星等基因组标记，在拟南芥中也发现了较高程度的多态现象。拟南芥中至少25个基因已
8、被系统地测序并在不同种类间加以比对，其数量仍在快速地增加，这些基因主要包括花序形成和分生组织发
