氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞

《氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、2010/11/07氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理 转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞

2、制备方法有CaCl2和RbCl法。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。实验方法一

3、、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。三、试剂准备1.LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入1

4、0mol/LNaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。1)分装出100mlLB液体培养基（不含抗生素）。2)分装3支3ml的液体培养基。3)其余200ml用于制备LB固体培养基：分装3个50ml，分别加入0.75g细菌培养用琼脂。32010/11/071)高压后降温至65℃，制备2块氨苄抗性LB固体培养基（加48μl氨苄抗生素），2块卡纳抗性LB固体培养基（加200μl卡纳抗生素），2块无抗性LB固体培养基。2.将准备好的LB培养基，甘油，2个50ml离心管，80个1.5ml离心管，高压。3.Tri

5、s-CaCl2500ml（75mmol/LCaCl2，10mmol/LTris.Cl，pH6.5）：称取CaCl24.1621g，Tris0.6057g，先在烧杯中加约200ml的ddH2O用磁力搅拌器混匀，然后再加ddH2O定容至500ml，用盐酸调至pH6.5,最后再将配制好的Tris-CaCl2吸入30ml注射器中并经0.45um针头滤器过滤，方可得到最终的Tris-CaCl2500ml（75mmol/LCaCl2，10mmol/LTris.Cl，pH6.5）溶液。4.卡那霉素：10mg/ml溶于水，工

6、作浓度50μg/ml，3ml菌液加大约15μl卡那（1ml菌液加大约5μl卡那），以水为溶剂的抗生素储存液应用0.22μm滤器过滤除菌。5.氨苄青霉素：50mg/ml溶于水，工作浓度60μg/ml,3ml菌液加大约4μlAmp（1ml菌液加大约1.2μlAmp）。四、操作步骤1.受体菌培养：1)无菌接种环刮取冻存于-70℃的大肠杆菌菌种DH5α，划线接种于不含抗生素的LB固体培养基上，37℃培养16h左右。2)挑取一单个菌落，接种于3ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。2．感受态细胞制备（

7、CaCl2法）：准备冰浴，预冷的Tris-CaCl2和50ml离心管，甘油，80个封口膜，80个离心管1)吸取2ml菌液接种于37℃预热的100mlLB液体培养基中（1：50的比例），37℃振荡培养2.5~3h（后一个小时随时观察细菌生长情况）。2)无菌条件下，将培养液转入2个无菌预冷的50ml离心管中（以下操作均需无菌且在冰浴中进行），冰浴30min，冷却至0℃。3)4℃，5000r/min离心10min。4)弃上清，倒置离心管，使残留液体流尽，使细菌悬于10ml（每个管）预冷的Tris-CaCl2溶液中，

8、冰浴15min。5)4℃下，5000r/min离心10min。6)弃上清，每个管用2ml冰预冷的含15%甘油（300μl）的Tris-CaCl2保存。7)用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌离心管中，50μl/每管，贮存于-70℃。3．检测：准备冰浴，42℃水浴32010/11/071)将10μl已有的分别含Amp，Kan的质粒转化到制得的感受态菌中。2)冰浴30min，42℃水浴45s（<1min），