高效液相色谱仪的使用

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1、高效液相色谱仪的使用仪器的组成1泵2进样器3柱温箱4检测器5数据输出设备分离原理溶液流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发上作用（吸附、分配、离子吸附、排阻、亲和）的大小强弱不同，在固定相中的停留时间就不同，从而先后从固定相中流出。常见的检测器还有差示折光检测器（通过连续测定流通池中溶液折射率来检测试样浓度）、电导检测器（根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质浓度）。光电二极管阵列检测器：紫外检测器的重要进展，全波长扫描、准确定性。仪器的使用流动相的选择对样品有适宜溶解性（试溶解样品

2、）不能用纯乙腈（粘度大，容易在单向阀上形成液膜）流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应所有流动相都应该用色谱纯级，水为超纯水，并且使用前应过滤、超声脱气流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中峰拖尾的处理添加10-30mMol三乙胺(triethylamine)可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾添加1%醋酸或10-30mMol磷酸盐可以抑制酸性化合物拖尾色谱柱的保护一般情况下，使用前用甲醇冲柱30min，再换流动相。使用完毕后用50%甲醇冲柱30min，再用纯甲醇冲柱至柱压稳定。

3、若流动相中有缓冲盐（乙酸、磷酸盐等）应先用纯水冲柱30-60min，然后同上。注意事项1清洗进样针的液体应该是溶解样品的溶剂2样品在进样前，必须经微孔滤膜过滤3由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈4溶解样品和标准品的溶液应相同常见问题1柱压不稳2保留时间不稳定3峰型不好4不出峰（检查流动相配比是否无误、清洗进样针）5基线不稳解决方法1检查是否漏液2检查管路中是否有明显的气泡3观察柱温是否稳定4若无上述情况，可用水、异丙醇、甲醇、0.1mol/L的盐酸溶液高流速（

4、5-8ml/min）冲洗管路5经4处理后，若还不正常，可拆下单向阀依次用水、甲醇、异丙醇超声清洗准备工作1、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。3、配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动

5、相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；样品数据分析物质的定性淫羊藿苷标准品淫羊藿提取液定量计算A样品C样品A标准品C标准品=公式中：A为峰面积、C为浓度常用的计算方法还有归一化法、内标法。色谱条件：流动相：甲醇-水（50：50），色谱柱：C18色谱柱，检测波长：270nm，柱温：30℃，流速：1.0mL/min。样品前处理：取药材细粉0.3g，精密加入甲醇50ml定重，加热回流1h，放冷再定重，补充损失甲醇，摇匀，经0.45μm过滤即可上机检测。标准品浓度：0.

6、6mg/ul，供试品浓度6mg药材/ml。HPLC检测实例：丹参酮IIA含量的HPLC测定实验数据及处理（1）、以色谱峰面积为纵坐标。丹参酮标准系列溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。（2）、根据试样溶液色谱图中标准品对应时间的峰面积，计算得出试样溶液中丹参酮IIA的含量。