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1、中国神经免疫学和神经病学杂志2004年1月第11卷第1期ChinJNeuroimmunol&Neurol2004,Vol.11,No.1·53·细胞凋亡的检测方法(综述)矫毓娟,刘江红综述许贤豪审校(卫生部北京医院神经内科,北京100730)摘要:近年来,细胞凋亡一直是生物医学领域各专业的研究热点,凋亡检测技术种类繁多却并不完善,此文就凋亡的特征以及常用的细胞凋亡的各种定性、定量检测方法的优缺点做一综述,同时提及了重要的凋亡调控基因和凋亡相关因子的检测。关键词:凋亡;检测方法;调控基因;凋亡相关因子中图分类号:Q255文献标识码:A文章编号:100622963(200
2、4)0120053204细胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的细胞自细胞的胞膜完整性受到破坏,细胞不需固定即可被主的有序性死亡,又称为程序性细胞死亡(pro2PI染色。凋亡细胞的胞膜成分亦发生改变,在凋亡grammedcelldeath),是真核细胞的一种特殊的死早期,原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)[4]亡形式。细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤迁移至脂双层外侧。另外,细胞凋亡时核酸内切发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来酶被激活,首先将DNA切成50～300kb大小的一直是生物医学领域各专业的研究热点。所以,在DNA,然后进一步将染色质
3、裂解成单个核小体和研究中如何选择凋亡检测方法很为关键。此文就凋寡聚核小体,形成180～200bp的DNA片断。而坏亡的特征及常用的细胞凋亡的各种定性、定量检测死细胞DNA断裂无规律性。方法做一综述。2细胞凋亡的检测方法1细胞凋亡的特征211电镜形态学观察虽然光学显微镜下可以看见[1][5]111形态学改变1972年Kerr等就是根据形胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变态学的变化将凋亡细胞和坏死细胞区分开来。细胞化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满凋亡的早期形态学改变是核染色质浓聚、固缩,聚意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同集在核膜周边,
4、然后是胞浆浓缩、胞膜起泡,继而细时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最胞核裂解成若干碎片,细胞膜将胞质和染色质断片经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标包裹,胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及准。缺点:(1)只能定性,不能定量;(2)标本处理过[2]“凋亡小体”(apoptoticbody)。这不同于细胞坏程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较死的细胞肿胀、胞膜破裂、细胞崩解。高,不适于大批标本检测;(3)在组织切片上进行电112生化改变早期凋亡细胞及活细胞的胞膜正镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴[3][6]常,DNA染料碘化丙
5、锭(PI)拒染,但可被另外别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时[7]一种DNA染料Hoechst342(Ho342)染色;而坏死进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。收稿日期:2002211215;修订日期:2002212204基金项目:北京市“十五”攻关课题资助项目(H01021055011)作者简介:矫毓娟(19712),女,黑龙江人,在读博士生,主治医师。通讯地址:卫生部北京医院神经内科,北京100730。联系电话:(010)65212012。许贤豪(19372),男,上海市人,教授,博士生导师。1980—1986年,先后于美国纽约市蒙塞奈医院、重症肌无力
6、中心和白塞斯达市美国国立卫生研究院、神经病学研究所神经免疫研究科做访问学者,主要从事神经病学、神经免疫学、老年病学研究。通讯地址:卫生部北京医院神经内科,北京100730。联系电话:(010)65212012。Fax:(010)65212386。(通讯作者)·54·中国神经免疫学和神经病学杂志2004年1月第11卷第1期ChinJNeuroimmunol&Neurol2004,Vol.11,No.1212DNA凝胶电泳(DNAladder)凋亡过程中接到断裂DNA的3′2OH端发生聚合反应,然后进DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重行检测。此法与流式细胞技术相
7、结合可定量凋亡细要过程,DNA凝胶电泳也曾被认为是细胞凋亡判胞的百分比;与免疫组化结合可进行形态学分析。[8]定的金标准之一。抽提细胞的DNA,确定样品中细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含DNA的量和纯度,然后在琼脂糖凝胶上电泳。正常量减少,因此该方法较之前述各法具有更高的灵敏活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带;细胞凋亡性。另外,研究证明TUNEL的敏感性远高于时,由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小ISNT,尤其是对早期凋亡的检出TUNEL更为适体,电泳时呈现特征性的“阶梯状”(ladder)条带,用。这两种方法还可以同时进行细胞表面标志
