miRNA_海绵_重组质粒的构建及对miR_483_5p的敲减

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1、第45卷第1期哈尔滨医科大学学报Vol．45，No．12011年2月JOURNALOFHARBINMEDICALUNIVERSITYFeb．，20111基础研究miRNA“海绵”重组质粒的构建及对miR-483-5p的敲减*马宁，王曦迪，乔瑜，李福源，惠洋，邹朝霞，周凌云，高旭(哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室，黑龙江哈尔滨150081)［摘要］目的建立microRNA失功能(lossoffunction)研究模型，为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段

2、，称为“S-483”，将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中，构建pCAGGs-S-483重组质粒。利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞，经re-al-timePCR对成熟miR-483-5p含量进行检测。结果转染pCAGGs-S-483组miRNA-483含量(0.33±0.04)较转染空质粒组(1.00)明显下降(P＜0.01)，但对其它miRNAs无影响。结论S-483海绵策略可有效“吸附”并降低miR-483-5p，成功构建了pCAGGs-S-483重组质粒，为其功能研究和miRNA敲减动物的建立提供了

3、有益借鉴。［关键词］miRNA海绵;miR-483-5p;敲减［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1000－1905(2011)01－0001－04MicroRNAspongesknockdownmiR-483-5pinHepa1-6cellsMANing，WANGXi-di，QIAOYu，LIFu-yuan，HUIYang，ZOUChao-xia，ZHOULing-yun，GAOXu(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，HarbinMedicalUniv

4、ersity，Harbin150081，China)Abstract:ObjectiveTostudymicroRNAfunctioninvitro，ageneticstrategiesisrequiredtogenerateloss-of-functionphenotype．MethodsTherecombinantplasmidswhichexpressed"microRNASponges"，asixcopiesantisensesequencetomaturemicroRNAmiR-483-5p，werecons

5、tructed．ThemiR-483-5pspongesplasmidsweretransienttransfectedintomouseHepa1-6cells．Real-timePCRwasperformedtoidentifytheamountsofmaturemiR-483-5p．ResultsTheamountofmaturemiR-483-5pwasknockdowned(0.33±0.04)bythemicroRNAspongesrecombinantplasmidswithcontrolgroupas1

6、．00(P＜0．01)．ConclusionThemicroRNAspongesstrategiestoknockdownmicroRNAiseffectiveinloss-of-functionresearch．Keywords:microRNAsponges;miR-483-5p;knockdownMicroRNA是一类具有转录后水平基因表达调点之一是对其生物学功能的探索。功能研究策略主控作用的非编码小分子RNA。目前，该领域研究热要是通过改变体内成熟miRNA的含量，在分子、组织、整体等水平分析出现的表型。人工合

7、成的miR-NA拟似物和拮抗物的应用为其功能研究提供了可［收稿日期］2010－05－20［1］［基金项目］国家自然科学基金资助项目(81070457);黑龙江省自能，但其作用时间短、无法传代等不足也制约了然科学基金青年基金资助项目(QC2010002)miRNA在肿瘤、代谢等疾病中的功能研究。利用质［作者简介］马宁(1979－)，男，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士研粒过表达miRNA前体及其上下游侧翼序列已成为究生。*通讯作者2哈尔滨医科大学学报第45卷［2-4］体内、体外稳定持续表达miRNA的主要手段;对于敲减，由于m

8、iRNA分子小，难以应用传统的针对编码蛋白基因的siRNA进行RNA干扰，亟需新的敲减技术的出现。microRNA“海绵”(Sponges，SP，S)技术于2007［5］年由诺贝尔奖得主PhillipA．Sharp提出，他的团队利用多拷贝、不完全互补的miRNA反义序列特异“吸附”miRNA，以降低成熟miRNA含量。几年来，应用