普通光学显微镜的原理与使用

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1、普通光学显微镜原理与使用河北大学细胞生物学实验室主要内容显微镜的发展显微镜的光学原理显微镜的几个基本概念显微镜的结构显微镜的使用显微镜的维护要知道的几个重要的分辨率人眼：0.2mm/250mm光学显微镜：0.2um电子显微镜：0.2nm1.显微镜的发展1.1人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。人眼视锥细胞直径为4微米，对应的视角约为30秒，这个角度就是视角的极限。一般要

2、能清晰的分辨两个点，视角须在1分以上。高1米的物体距眼睛3400米时，视角为1分。1.2放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有3—5x1.3显微镜：1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，罗伯特·虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍列文虎克和他的显微镜（约1680）

3、2显微镜的光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。2.2凸透镜的五种成象规律(1)当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象；(2)当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；(3)当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；(4)当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；(5)当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的

4、形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。2.3显微镜的成像原理显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。3显微镜的几个基本概念3.1光源：能发射光波的物体。可

5、见光频率范围：7.5×1014-3.9×1014Hz。真空中对应的波长范围：390nm–760nm相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红3.2分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。D=0.61λ/nsinD：分辨率λ:光波的波长N:介质折射率α:物镜镜口角3.3孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角称为孔径角。3.4数值孔径：令N·A=nsin,叫物镜的数值孔径。数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率越高。物镜数值孔径3.5放大率在显微镜下

6、所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的500――1000倍。3.6像差像差球差象散慧差场曲负畸变正畸变色差球差校正色差校正3.7焦点深度在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。焦点深度3.8视场数目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。

7、所以说视野与显微镜的总放大率成反比。在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值．3.9工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。s1s2D**爱里斑瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合时，

8、这两个点光源恰好能被分辨。恰能分辨能分辨不能分辨提高显微镜分辨率的