桉树青枯菌菌株致病力分化、吸附识别及PCR快速检测研究

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1、摘要桉树是世界三大速生造林树种之一。随着桉树人工林面积的不断扩大，桉树病虫害问题也越来越突出，病虫害种类不断增加，危害程度愈加严重，严重影响了桉树的正常生长，降低了木材和其他林产品的产量和质量。目前在桉树病虫害中，青枯病的危害最严重，危害范围最广，给桉树生产造成很大的经济损失。前人曾对桉树青枯病的病原、发病规律和防治方法等进行了一系列研究，取得了一定进展，但对桉树青枯病的病原学和致病机理了解还比较少，缺乏对桉树青枯病全面而系统的了解。本文对青枯菌致病力及桉树无性系抗性分化、青枯菌遗传多样性、青枯菌对桉树的吸附和侵染识别过程以及分子检测方法等4方面进行研究，以期深入了解桉树青枯病的

2、侵染发病机制，为桉树生产中无性系的合理布局、防止青枯菌传播和蔓延提供理论和技术支撑。本研究主要结果如下：(1)选用DHl96和DH32．22两个无性系，采用水培接种法对华南地区30个桉树青枯菌菌株致病力进行了测定，发现华南地区桉树青枯菌菌株问致病力存在显著差异，且与地理来源之间无明显相关性，同一地区致病力强弱菌株并存。(2)从30个测定的菌株中选择强、中、弱各2个致病力不同的菌株与12个生产中常用的桉树无性系采用灌根接种法交叉接种发现，供试无性系对青枯病抗性也具有一定差异，无性系DHl96、T13、DH32-29抗性最弱，DH32-22、9113、21、U6、9224抗性中等，井

3、岗一号、DH．201-2、EG5和广林9抗性较强。(3)在对菌株致病力和无性系抗性测定中发现，青枯菌菌株和桉树无性系间存在显著的交互作用，植株的发病程度取决于病菌的致病力、无性系的抗病性以及二者的交互作用。在实际生产中应选择抗性较强的品系，同时兼顾不同抗性无性系合理布局，充分利用无性系的抗病性控制青枯病的发生和危害。(4)首次利用AFLP分子标记对华南地区30个桉树青枯菌菌株的遗传变异进行了研究，有助于了解病菌的遗传分化，病菌的流行学特征等多方面的信息。通过研究发现，来自华南地区的30+桉树青枯菌菌株间遗传变异较大，多态性高。不同菌株间的遗传关系与致病力强弱具有一定的相关性，致病

4、性相近的菌株亲缘关系较近；而菌株的遗传关系在地域上则呈现大杂居小聚居的分布格局，在小的地域范围亲缘关系较近，但相距较远的地区也有亲缘关系较近的菌株。(5)用强弱两菌株接种无性系DHl96，结果发现，青枯菌对桉树根部吸附识别的最适温度条件是30"(2，此时病菌新陈代谢旺盛，运动能力强，对根表吸附量和根部侵入量高。环境中pn值为中性至弱酸时最有利于青枯菌对桉树根表的吸附识别，此时细菌易于成功吸附到根表细胞表面，进而定殖和侵入。细菌接种浓度对吸附识别具有重要影响，高浓度青枯菌的群体效应使青枯菌能够克服寄主的防卫机制成功吸附定殖，青枯菌对细胞表面的吸附可能具有特定的位置效应，过高浓度的细

5、菌，其吸附量和侵入量并不能继续增加。(6)本研究制备了粗提纯的胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)，无EPS和无EPS与LPS的菌株，通过测定青枯菌的根表吸附量和根部侵入量，研究EPS和LPS在青枯菌对桉根部吸附和侵入过程中的作用。结果表明：在接种青桔菌的6h内，EPS处理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量明显升高，而LPS处理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量都明显下降；无EPS菌株的根表吸附量和根部侵入量都明显降低，无EPS及LPS菌株的根表吸附量和根部侵入量亦有所下降，但不如无EPS菌株下降明显。EPS具有促进青枯菌对桉树根部吸附和侵入的作用，LPS卿

6、具有抑制作用。(7)使用

7、致病力强弱不同的5号和12号菌株接种桉苗，在接种后1．0h、2．oh、4．oh、6．Oh、24h分别取样，扫描电镜观察发现，青枯菌的根表吸附量在初始的6．Oh时问里具有明显的积累效应，强毒菌株的根表吸附量明显高于弱毒菌株，并开始在根表增殖，与细胞发生作用，侵入寄主。(8)扫描电镜观察发现，青枯菌侵入桉苗无伤幼根的途径可能是通过青枯菌分解作用，破坏根表细胞壁进入根内。青枯菌能分解根表细胞壁，使根表细胞变形，细胞之间出现较大的缝隙，进而从缝隙间侵入寄主。本研究证明了青枯菌是在桉树维管柬导管及相邻组织内迅速增殖和广泛分布堵塞输水管而导致桉树枯萎。桉苗接种青枯菌2．oh，根茎切片只发现少

8、许白色的浓密物质，6．0h后，也只能看到稀少的几个病菌，但接种2411后，就可以观察到大量的病菌存在于维管束的导管及细胞间隙，堵塞导管并引起植株表现枯萎症状。(9)以带有青枯菌的桉树组织为材料，采用4种不同的提取方法抽提青枯菌DNA，同时利用青枯菌特异性引物进行PCR扩增，比较了4种DNA提取方法及PCR检测灵敏度。结果表明，煮沸法和热裂解法操作相对简单，但检测灵敏度较低，检测限分别为104ⅡCFU／mL和103CFU／mL；简化提取法和试剂盒法检测效果较好，均可检测到102CF