采用膜分离法从猪血中分离纯化凝血酶的工艺研究

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1、呆用膜分离藩从猪血中分离纯化凝血酶的工艺研究曹芳，李耀曾，杜兴(1．平凉市药品检验所，甘肃平凉7；2．甘肃省药品检验所，甘肃兰州73oooo)摘要：目的从猪血中分离纯化凝血酶。方法根据猪血凝血酶原及其凝血酶的分子量，采用膜分离技术分离纯化猪血凝血酶。结果采用膜分离技术分离纯化猪血凝血酶，其比活力与活力回收率分别比有机溶剂沉淀法提高了78．5U／pr0-mg(6．0倍)和37．1％。结论膜分离法是分离纯化猪血凝血酶较理想的方法，适宜中、小企业生产。关键词：膜分离法；猪血凝血酶；猪血凝血酶原中图分类号：R282．74文献标识码：B文章编号：1671—1246(2oo9)I1-0l19_03

2、凝血酶原是一种糖蛋白，糖含量约占1l％，它是凝血酶未2．2蛋白质含量测定被水解的前体。猪凝血酶原的分子量约为7lOoo。凝血酶则是以牛血清白蛋白为对照，按福林酚法进行测定。凝血酶原经激活剂激活的产物，它是一种蛋白水解酶，在血液3工艺过程凝固过程中起重要作用。猪凝血酶的分子量约为4Ooo0。3．1分子量测定目前，凝血酶的提取主要采用有机溶剂提取法、等电点沉3．1．1凝血酶原与凝血酶的纯化按3．2项下方法从猪血中制淀法、硫酸铵分级分离法、氢氧化镁吸附法以及柠檬酸钡吸附备凝血酶原，取其中1，2凝血酶原，激活后，将凝血酶原及被激法收集凝血酶原，再经激活一丙酮或乙醇沉淀等方法制成。本活的凝血酶分

3、别上Sephadex—G一75色谱层析柱，用0．025m0l门L文根据猪血凝血酶原及其凝血酶的分子量，采用膜分离技术，的柠檬酸钠溶液进行洗脱，收集活性最高部分，迅速冻干，减压分离纯化凝血酶，实验结果表明，该技术稳定、流程短、收率高、真空干燥，备用。效价高，方法可行，结果理想。3．1．2标准分子量物质及样品的制备与测定按文献方法进行I3】。1仪器、材料和试药用sDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法l测定各标准分子量物质及待新鲜猪血(采自平凉市肉类联合加工厂)，聚丙烯腈膜测样品的分子量，以各蛋白质标准品的迁移率(Rm)为横坐标，(PAN)．截留分子量为：20ooO一3O00o、300oO一40oo0

4、、40oo0～蛋白质分子量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲5OO00、60OoO一7Oooo'70Ooo～800o0(定做)。牛凝血酶标准品、线(见图1)。2牛纤维蛋白原、标准分子量物质(分子量1400o～97O00)、牛血00清白蛋白(分子量68O0o)、细胞色素c(分子量11700)、糜蛋48白酶(分子量2570o)和胃蛋白酶(分子量355o0)、SDS一聚丙=4．6+系列l烯酰胺(均购自中国药品生物制品检定所)，凝血致活酶(自制)。{4用于凝血酶效价、蛋白质含量及分子量测定的试药及试剂均为{2分析纯。l8ooG型紫外一可见分光光度计(北京分析仪器有限公40司生产)，离心

5、机(上海医用分析仪器厂生产)。()O．2O．4(】6O802方法迂移率t)2．1凝血酶的效价测定图lSDs一凝胶电泳法测定各分子量分布图按照《中国药典》(2oo5年版)二部凝血酶冻干粉中效价测从标准曲线图上查得Rm及其对应的lgrn，再根据lgm计定法I隧行测定。算出相应的标准品及待测样品的分子量，结果见表l。4根据培养目标．建立评价体系．改革实训考核方法推拿的主动性和积极性，使学生牢固掌握基本理论和操作技为突出针灸推拿实训教学的重要性，根据教学大纲和课程能，提高参与科研能力及分析问题、解决问题能力；培养了实用特点，把针灸推拿实训课作为独立的一门课程进行教学和考型、复合型人才；顺应了针

6、灸推拿治疗疾病、强身健体及美容美核，合理安排考核方法，并且按适当比例制定考核标准。具体做体的社会需求；体现了以就业为导向，为毕业生提供广阔就业法是：平时实训成绩占3O％(实训报告和平时表现)，实训理论空间的教育原则，取得了良好的教学效果。考核占3O％(以试卷形式考核)，基本技能考核占4O％(要求是参考文献：每人从穴位定位到功能主治再到针刺手法操作，人人过关)，以I1降石良．中国针灸在瑞士的发展概况lJ】．中国针灸，20o4，(2)：283～284．求客观、公正评价学生知识和技能的掌握情况。通过以上教学方法的改革，充分调动了学生学习中医针灸【21王辉文．国际针灸培训临床实习基地建设的探索

7、与实践m。成都中医药大学学报(教育科学版)，2oo4，12(2)：24～25．A一119—表1SDS一凝胶电泳法测定各蛋白质、样品的分子量表4表明，经PAN5膜截留后，活力回收率及酶比活力(效价)分别比有机溶剂沉淀法提高了37．1％和42．8u／pm．mg。3．3凝血酶的分离纯化3．3．1凝血酶原的制备按3．2．1方法制备凝血酶原。3．3．2膜的选择按3-2．2方法用PAN5膜分离纯化凝血酶原。收集被PAN5膜截留的膜上部分，立即用O．9％生理