根癌农杆菌介导芜菁花叶病毒的HcPro基因对茎用芥菜的遗传转化研究

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1、浙江大学硕士学位论文根癌农杆菌介导芜菁花叶病毒的Hc-Pro基因对茎用芥菜的遗传转化研究姓名：李春顺申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：陈利萍20050601摘要本研究以茎瘤芥(BrassicajunceaCoss．vat．tumidaTsenetLee)作为试验材料，分别以子叶和子叶诱导的愈伤组织为外植体，建立了农杆菌介导的芜菁花叶病毒He．Pro基因的转化体系，得到了茎瘤芥转基因植株。本研究不仅为利用现代病毒分子生物学和植物基因工程育种获得抗病毒农作物提供理论和技术依据，也为芥菜以及其他十字花科作物转基因技术提供技术平台。主要结果归纳如下：1．以子叶为外植

2、体的基因转化体系的建立茎瘤芥子叶可以在含有3m叽BA和0．5megLNAA的培养基上得到95％以上的不定芽再生率。本论文研究了预培养时间(2d，3d，4d)、共培养时间(2d，3d，4d)和共培养温度(20"C，24"C，28。C)对子叶转化效率的影响；还对农杆菌、抗生素对子叶分化的影响进行了研究。结果表明，预培养3d的外植体在284C共培养3d的条件下获得了最高的分化频率。经PCR鉴定，最高转化频率达16．34％。高浓度的农杆菌可以抑制子时的分化，随着侵染子叶的农杆菌浓度(OD6∞)从0．1上升到0．3，子叶的分化频率下降了43个百分点。研究还发现，羧卞青霉素与

3、头孢酶索都在一定程度上抑制了子叶不定芽的分化。2．以愈伤组织为外植体的基因转化体系的建立子叶切块可在含有O。25m班NAA，O。25mg／L2,4-D和0．5m班BA的MS培养基上被诱导成愈伤组织。本论文研究了外植体状态(不同继代次数)、共培养温度(20。C，24"C，28。C)和共培养时问(1d，2d，3d)对愈伤组织转化效率的影响；还对抗生素对愈伤组织分化的影响以及转化植株的遗传多样性进行了研究。结果表明，经2次继代的愈伤组织在24。C共培养2d的条件下获得了最好的转化频率，为3．95％。同时发现，羧卞青霉素与头孢霉索均对愈伤组织的分化有促进作用。RAPD分析

4、表明转化植株存在遗传多样性。3．转化植株的分子及抗病性鉴定经PCR及Southernblot检测，目的基因及筛选标记基因已经插入了茎瘤芥染色体基因组中。经病毒接种鉴定及ELISA分析，转化植株较对照株获得了较好的抗性，虽然没有完全抗病，但可以在一定程度L延迟发病。V关键词：茎瘤芥：子叶；愈伤组织；芜菁花叶病毒；Hc．Pro；基因转化VAbstractAtransformationsystemofHc—ProgenemediatedbyAgrobacteriumwasestablishedinthepresentstudy．Tubermustard(Brassica

5、junceaCoss．vat．“lmid口’rsenetLee)wasusedasthematerial．Cotyledonanditsinducedcallusoftubermustardwereservedastheexptants，andtransformedplantsweresuccessfullyobtained．Thisstudyprovidedtheoreticalandtechnicalbasisforobtainingvirus-resistantplantsbymodernmolecularbiologyandplantgeneticengi

6、neering，andtechnicalplatformforgenetransformationinmustardandCruciferaeaswell．Themdinresultswerelistedasfollows：1·EstablishoftransformationsystemusingCotyledonasexplantAdventitiousbudscouldbeefficientlyinducedOnMSmediumsupplementedwith3m#LBAand0．5m班NAA．Theeffectofpre-culturefime(2d，3d

7、，4d)，C0‘culturetime(2d，3d，4d)andCO—culturetemperature(20*(2，24。C，28"C)ontransformationefficiencyofcotyledonWASinvestigatedinthepresentstudy，Meanwhile，theeffectofAgrobacteriumandantibioticsonregenerationofcotyledonsWASstudied．Thebesttransformationfrequencywasfoundin3-daypre-culturedexp

8、lants