单侧输尿管梗阻后大鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶的表达及其意义

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1、浙江大学硕士学位论文单侧输尿管梗阻后大鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶的表达及其意义姓名：秦杰申请学位级别：硕士专业：外科学（泌尿外科）指导教师：谢立平2003.5.1堑垄奏登毯圭皇垒捻塞=皇塞攒墨单倔输屎瞥粳I飘后犬鼠肾脏诱导型一氧化氨台酶的表达及其意义淤汪大学飘学院2000级硕士研究生磐辩学(游躁羚秘攀)秦杰警嚣嚣立平毅援袋踩梗爨镁瘸交程缀羹要黎撼霞。瀑屎系统鹣粳结核和损伤等。i引起藤路梗礤的原因很多，瘸凝部位也不同，但最终均可是理臀较拳及膂强蹩受损。鬏播Bell《l艇磅靛一缀统毒卡，59064镶尸梭中，肾积水占3．

2、1％“3。尤其近几年随着人口逐步老龄化，其发病率厘有逐年增高静越势。因藏涟一疹’、沈识本瘸酌发瘸视稍，掌握有散前治疗方法，禚缓／疾瘸避震戆搔藏已越来越受爨窳度雪融。硬究袋露梗疆焘’器靛变纯懿常魇模型为单侧输墚管梗阻(uu。)模型岿前，国内对诱导型一氧化瓤合酶(iN。s)在UU0太鬣髯黥翡表达情况研究缀多。本研究鬻在窥襄iNOS在UUO大鬣4浮脏的表达及意义。，材料与方漱毛一、砑变对象1．实验动物雄性健凝Sprague—Dawley大鼠(由浙江省医学料学院动物中——堡垒查黧黧主兰堡黧基二主耋爨篓—一心凌爨)36只，

3、蒋夔28D±20竞。2．动物模型及分组制摄左侧输尿管攒腿模型缀(UUO缀，30只)，分术后4小时，12小时，24小对，3天和7天5个娥死组番6只，嗣时设假手术缎(c缓，6是)捧菇怼爨缀。动瀚模型参考重努Hochberg瓣大鬟以乙醚吸入麻醉，腹部难中切口，双重结扎左侧输尿管，缝合腹黢。假手术蠢来臻藐壹恻输嚣管，其拖操作同翁。所有动物均给予常规饮食和饮承。分别予术最4小对，12小醛，24小时，3天帮7天楚死大惑，取出援隧肾脏。部分肾组织用液氮保粹，后转入一86℃冰箱保存；其紫以10％中性平蘩溺定，薄《藏石蟮落冀，辍备

4、受疫缀往帮鬻艇染魏瘸。二、RT—PCR捡测：l弓1秘净列：GAPDH上游；j耪为：5’～T∞TGAAGGTCGGTGTGAAC-3’，下游罨l蝰为；S’一G嘏GGTGAAC,ACGccAGTAG-3’，扩增长嶷先305bp。iNOS上游弓l物为：5’一GGAGGAGCT6ATGGAGTAGCGG-3⋯下游引貔海：5’一C善盎CCTACCTGGGGAACACCTG麓一3’．参、矮长度为442bp。2．实验方法：将50rag--lOOmg冻存巍绠在液氮中碾瘵或耪束，翻入lmtTRIzol试裁掇取组织总RNA。取RNA

5、3ug用于逆转录，PCR发巍条件为；94度灏变性4min，然蔚32个循环的扩增，最尉72度避伸lOmin．每个镳器苞籍雏魔交往45s，57凄运袅45s，72度延孛争60s。PCR产褥经1．5％琼脂蝰电泳，遇过凝胶戏像系统读取髫蛉电溶祭潆的密度控搂毽，将iN0s条带与CAPDtt条带的比值作为iNOS的表达相对量。三、免痰缝纯检灏l-免疫缎化法检测iNOS在术侧肾脏中的表达：粱用ENVISION(两步法)，iNOS多克隆抗体(抗体稀释比1：t00)37℃60min；加入HRP标记的荦抗羲IgO(Envision二撬

6、)，3TC辩脔60min；DAB箍色。2鋈鋈查堂臻主兰堡篓壅二主塞黧垂2免疫缝纯强瞧继粟判定标准：挥难参考蚕内裁少毒[31。辍缝爨魏为呈稼色的阳性反应产物。在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为鞘性(o分)，鼹蝗绷胞率雀25％以下为弱爨l堡(2分)，25％-50％为阉性(4分)，50％以上为强阳性(6分)。鞠、统计学方法数据以平均数±标准差(：土s)表承，均数间结果eb较用方莲分横。所有资料均在SAS6．12软件下操作。尺0．05定为统计学差异有显

7、蓿性结莱l。鹭黢痰理改变肾脏的太体改变：UUO组梗阻侧肾脏堂缀增加。并出现不同程度肾盏和肾盂扩张，随着梗阻对间的延长，扩张稷度也明湿。光镜改变：UUO缝楼隧侧鹭黢赦‘驽肇健表现为集合蛰篱腔扩张，上皮萎壤，越接近紧鑫侧(远侧肾小管)越明显，j厦曲小管改变轻微，而肾小球保持正常结构。在炎细胞浸澜方面，UUO缀酌梗阻铡脊髓与缎手术缀精跑，UUO拳筋4h梗嫩侧肾脏米见明擞螅病理变化，ld后见小血管周阑有少量的炎细腿浸润，笫3d时炎细胞漫润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎鬃稳浸润。第7d爵炎维蕤浚润蹭多菇达戮离蜂

8、，渡革棱匿隧鳐巍秀主。2。各缌大鼠肾组织iNOSmRNA寝达水平经RT-PCR扩增后的iYOS为442bp，内参照GAPDH为305bp。RT-PCR的终莱显示：与馁手术筮大聚}l较，单爨赣瀑警援藤器援强大嚣疆疆铡肾皮质中即可见iNOS的mRNA表达辍度增强，于第24h明显增强，第3d达判高峰，以后大甑梗阻侧肾皮质中iNOS的mPuNA表达逐渐减弱，于第?d辩最羝。分攫蒜