SDSPAGE法测定Histag融合蛋白分子量产生偏差的原因

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1、万方数据植物生理学报，A砌弛】4叩b】7画口地唾∞s矗出口2咖．26(1)：“。鸸SDS-PAGE法测定His．tag融合蛋白分子量产生偏差的原因唐威华张景六王宗阳洪孟民(中国科学院上海植物生理研究所，上海200032)摘要：}矗争懈／M．NTA系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具，现常用于基因编码产物的特性研究中。sDs_PAcE是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法，而许多实验室用此方法检测}lis-t躯融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大，产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题，本实验室在研究一个m}tag融合蛋白P7

2、3一His时，首先用sDs_PAcE法测得其分子量确实比理论计算值大．然后对其进行c末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析，结果证实其实际分子量与理论值一致。酶切去除包括His—t鼯在内的部分肽段使sDs_PAGE法测量蛋白分子量的偏差大大降低，征实脚s-№#确实是造成偏差的原因之一。椎测由于}li争脚中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在sDs_PAGE中迁移变慢，而导致偏差。这一现象值得引起有关研究者的注意。关键词：}lis—tag／Ni—NTA，融合蛋白．sDs_PAcE，电喷雾质谱．分子量学科分类号：074近年来，在分子生物学或基因工程研

3、究中，为了便于得到被研究基因所编码的蛋白，往往将所研究的基因转化到大肠杆菌细胞中，经诱导物作用使之大量表达(H0cknev1994)。为j，使表达出的蛋白便于分离纯化，通常还在基因的5’端或3’端连接上某些核苷酸顺序，使表达出的融合蛋白含有与某些树脂有亲和作用的肽段，从而可以用亲和层析的方法很简便地将表达的蛋白纯化出来。His一脚r／Ⅳj—NTA系统就是这样一种方法，它将目标蛋白以与连续6个组氨酸残基(His．t矩)融合的形式在大肠杆菌中表达，利用His—tag与Ni离子的亲和作用，其表达产物可以用Ni一ⅣrA树脂一步纯化(}khul

4、i等1987)。由于引入的His_t职分子量小，几乎不影响蛋白原有的功能，而且纯化方便，这一系统现已为许多分子生物学研究者采用。但在实际工作中采用这一系统时也会遇到一些问题，首先遇到的就是融合蛋白分子量的检测问题。目前许多实验室测定蛋白质分子量通常是用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDs—PAcE)的方法。此方法主要是利用被分析的蛋白分子在SDS、巯基试剂存在时经加热处理而发生变性，并与sDs分子结合成带负电荷的粒子，经电泳，由于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，不同大小的蛋白质分子向阳极移动有快慢的区别，因此可以由电泳后各蛋白的泳动

5、距离推算其分子量(saIllbr00k等1989)。由于sDs．PAcE法测定蛋白质分子量已是一种很成熟的实验手段，许多实验室也将此方法用于His—t《融合蛋自分子量的检测，以初步判断表达的纯化产物是否预期的蛋白。但是不少研究者发现His．t《融合蛋白在sDS—PAcE中表现出的分子量大于其应有的分子量(Ham00d1994)，一些研究者在文献中提到了这一现象(Niu和Gu埘nan1994)，另一些研究者则回避了这一问题(瞄m和ch埘g1997，DeM撕a和Brewer1996)，但他们对蛋白确切分子量都未作进一步测定，对造成偏差的原

6、因也未进一步研究。本实验室计划采用His—ta∥Ni—NTA系统对一系列新克隆到的水稻基因进行表达及产物纯化，因此试图首先搞清这一偏差的产生原因。本文报告在将所研究的一个水稻cDNA片段c73的5’端连接上一段含有His．咄编码顺序的核苷酸后，在大肠杆菌中表达出的融合蛋白通过与Ni。N1H树脂的亲和层析加以纯化。用S畦PAGE方法测定纯化蛋白的分子量时，的确观察到它比理论计算的分子量偏大j，许多。但我们进一步对纯化的融合蛋白的C末端氨基酸顺序进行了测定，并用电喷雾质谱分析证实该蛋白确系我们所要的目标蛋白，而且其实际分子量与理论计算值相

7、符。这就证明了用His．ta∥Ni—NTA系统纯化得到的His．‘ag融合蛋白是正确的，其分子量并未发生改变，而是在采用SDS—PAGE方法测定时造成偏差。我们还将融合蛋白中His．t职切除后再用SDS—PAGE法检测，证实Hjs—l口是造成这一偏差的原因之一。1材料与方法1．1实验材料1．1．1仪器Mini．pIDtein蛋白电泳仪(Bio—Rad)，PE_ABI491Procisec蛋白质序列仪，电喷雾质谱仪1999—02．10收到．1999—06一18接受。本项目爱国家自然科学基金会资助(项目批准号39893322)。万方数据l

8、期唐威华等：sDs_PAGE法测定碰s’tag融合蛋白分子量产生偏差的原因65QuatⅡD。1．1．2工具酶专一性蛋白水解酶——凝血酶(thmIllbin)购自Si舯a公司。1．2实验方法1．2．1蛋白的飒's．n蝣E分