诱导型一氧化氮合酶在翼状胬肉中的表达及其意义

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1、诱导型一氧化氮合酶在翼状胬肉中的表达及其意义作者：颜美荣　李正贤　刘庚勋　周一鸣　彭昌福　王芳【摘要】目的探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在翼状胬肉中的表达及发病过程中的作用。方法采用免疫组化Elivision法检测20例翼状胬肉、10例正常结膜中iNOS的表达。结果20例翼状胬肉中iNOS的阳性表达率为80%(16/20)，正常结膜中iNOS的阳性表达率为0(0/10)。iNOS阳性表达两组间差异有显著意义，P<001。结论iNOS在翼状胬肉中的高表达，提示iNOS可促进血管形成，可能与翼状胬肉的发生、发展有关。因此，抑制iNOS可望成为治疗翼状胬肉，减少术后复发的新思路。【

2、关键词】诱导型一氧化氮合酶；翼状胬肉；血管形成；免疫组织化学近年来的研究发现,7一氧化氮合酶(NOS)活性的增高与肿瘤血管生成有关[1]。翼状胬肉的发生发展其发病机制目前仍不十分清楚，翼状胬肉是一组织增生性疾病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长侵入角膜为其特点。有细胞异常增殖和凋亡，与肿瘤有相似之处。它的形成、发展和术后复发需要新生血管化参与。翼状胬肉组织中是否存在NOS的高表达，鲜见报道。本研究通过检测翼状胬肉中iNOS的表达水平，探讨iNOS在翼状胬肉发病机制中的作用。　　　　1材料和方法　　1.1一般资料　　选择本院2004—2005年门诊及住院的20例翼状胬肉患者的手术标本。静

3、止期5例，进行期12例，复发性3例，其中男13例，女7例，年龄37~65岁，病程11个月~9年；对照组为同期手术的10例正常结膜组织，年龄35~62岁，所有病例均无其他角膜、结膜疾患。标本经10%甲醛固定、常规脱水、石蜡包埋。　　1.2方法　　标本经固定后，常规脱水石蜡包埋，作3μm连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。切片脱蜡至水化，3%过氧化氢孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡3×2min，微波炉抗原修复（95~98℃），自然冷却至室温，加入1：100NOS单克隆抗体，37℃孵育30min，或4℃过夜，用普通小鼠IgG及PBS代替一抗作阴性及空

4、白对照，PBS冲洗3×72min，滴加增强剂（A），37℃孵育30min，PBS冲洗3×2min，滴加生物素聚合物（B），37℃孵育30min，PBS冲洗3×2min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察照相。　　1.3染色结果判断　　阳性细胞为呈棕黄色颗粒的阳性反应产物。每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。NOS表达结果分为阴性（－）：无阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞率<50%；强阳性（++）：切片中阳性细胞率>50%。　　1.4统计学处理　　结果应用χ2检验。所有数据在SPSS1

5、1.0统计软件上进行，以P<0.05为差异有显著性。　　2结果7　　iNOS主要表达于翼状胬肉组织细胞的细胞浆和细胞膜内，少数表达于细胞核，iNOS表达阳性的细胞分布无明显规律，但静止期、进行期和复发性翼状胬肉的阳性细胞分布不同，静止期阳性细胞仅定位于上皮基底部，且呈散在分布，进行期阳性细胞增多，且向表层发展，复发性翼状胬肉阳性细胞明显增多，定位于上皮全层，染色最深。iNOS在翼状胬肉的阳性表达率为80%（16/20）。iNOS在正常结膜细胞内无阳性表达，阳性表达率为0（0/10）。iNOS在翼状胬肉及正常结膜的表达存在显著性差异（P<0.001），详见表1。表1iNOS在

6、翼状胬肉及正常结膜的表达情况（略）　　3讨论　　一氧化氮（NO）是近年来发现的生物体内重要的细胞内信使分子，分子量极小，但在人体的生理、病理过程中起着重要作用，与多种疾病，特别是肿瘤的发生发展过程密切相关。一氧化氮合酶是催化NO生物合成的关键酶，在正常组织中很少表达，可由炎症、缺氧等刺激因素诱导巨噬细胞、炎性嗜中性粒细胞及肿瘤细胞等产生。目前已知体内有3种NOS，分别为神经型(nNOS)，内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。nNOS，eNOS属于结构型NOS(constructiveNOS，cNOS)，其活性变化受Ca2+和钙调蛋白调节，又称钙离子依赖型。一般认为，cNOS催化生成

7、的NO主要参与维持血管舒张和神经信息传递等;而iNOD不受Ca2+和钙调蛋白调节，生理状态下不具备活性，但在各种刺激因素下诱导活化，参与多种病理过程[2]。近年来人们在对NO与肿瘤生物学行为的研究中发现，NO合成关键NOS与肿瘤的生长有直接关系。即在多种肿瘤细胞中存在活性增高的现象。NO可以促进肿瘤血管生成,增强肿瘤组织的血液供应,7从而促进肿瘤细胞生长。翼状胬肉并非肿瘤，但具有肿瘤类似的特点，细胞异常增殖和凋亡。肿瘤血管形成是肿瘤生长和侵袭转