豚鼠气道平滑肌的急性分离及KATP通道单通道电流的记录

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1、豚鼠气道平滑肌的急性分离及KATP通道单通道电流的记录【摘要】目的：建立急性分离豚鼠气道平滑肌的方法，并初步分析ATP敏感钾通道(KATP通道)单通道电流的性质。方法：急性分离出豚鼠3～4级支气管，并用链霉蛋白酶E分散气道平滑肌细胞，应用膜片钳技术的内面向外式记录方法，研究气道平滑肌KATP通道单通道电学性质。结果：成功记录到电导为112.4±5.14pS的、可被优降糖所阻断的KATP通道单通道电流。钳制电压在0～-60mV之间，通道电流无整流现象，且未见时间依赖性失活。结论：建立了急性分离豚鼠气道平滑肌的方法，并成

2、功记录KATP通道单通道电流，为进一步研究气道平滑肌KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基础。【关键词】气道平滑肌;急性分离;ATP敏感钾通道;单通道电流气道平滑肌的主要作用是调节气道的紧张度和口径[1]。气道平滑肌收缩是呼吸系统疾病中气道阻力增高的主要原因之一。多种ATP敏感钾通道(ATPsensitivepotassiumchannel,8简称KATP通道)开放剂，如吡那地尔(pinacidil)[2]、克罗卡林(cromakalim)[3]，可以使气道平滑肌松弛，并且这种作用能被KATP通道特异性阻断剂优降

3、糖所阻断。因此，KATP通道在调节气道平滑肌的舒张和收缩中起着重要作用，但其单通道电学性质一直未能阐明。本研究利用改进的气道平滑肌分离方法分离细胞，并用膜片钳技术研究了气道平滑肌KATP通道的单通道性质，为进一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基础。　　1材料和方法　　1.1支气管平滑肌细胞急性分离　　气管组织制备和保持：取健康豚鼠(雌雄不分)，体重300～400g，用3%的戊巴比妥钠盐4ml/kg腹腔麻醉后，取出气管和肺组织，立即置于4℃用95%O2+5%CO2饱和的HPSS液(成分(mmol/L)：Na

4、Cl126，KCl5，HEPES10，CaCl22，MgSO42，DGlucose10,pH7.3(NaOH))中。分离两侧肺组织中的3～4级支气管。去除上皮细胞和外侧面的结缔组织和肺组织后，放入含10mlHPSS液的浴槽底部平衡。内含青霉素(20U/L)和链霉素(20μg/ml)。温度保持在32℃，通以95%O2+5%CO2混合气。　　分离支气管平滑肌细胞：取3mlHPSS液和4.5mg链霉蛋白酶E(PronaseE)放入10ml离心管中，将切成1mm2的支气管组织放入底部，上方通以混合气，温度37℃，pH7.4

5、。消化30～40min后洗去残余酶。在HPSS液中，用针头将气管组织分离成丝状，在常温下分别用尖端抛光处理的直径为300μm和150μ8m的Pasteur吸管连续吹打，使组织分散，细胞游离。取上部细胞悬液，置于HPSS液中，放在4℃冰箱保存，供6h内使用。整个消化过程需通以95%O2+5%CO2混合气。实验时，取细胞悬液加到培养皿内的盖玻片上，此盖玻片事先涂有0.1%的多聚赖氨酸。静置10min后，加入2mlHPSS液洗去盖玻片上多余的组织碎片和未附着在盖玻片上的细胞。镜下观察细胞形态。通道记录仅选用细胞膜完整、有立

6、体感、胞体呈梭形的细胞。　　1.2单离子通道记录与分析　　采用膜片钳技术的内面向外式。浴槽液成分为(mmol/L)：KCl140，CaCl21，NaCN2，HEPES10。电极液成分为(mmol/L)：KCl140，CaCl22，MgCl21，TTX0.001，CdCl20.3，HEPES10。加入TTX和CdCl2的目的在于分别阻断电压依赖性Na+和Ca2+通道。通过通道可被优降糖(10μmol/L)所阻断，确定为ATP敏感钾通道。在实验之前，所有溶液的pH值均调到7.2，并用0.22μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤，以

7、除去灰尘颗粒和细菌。实验在室温下进行(21～27℃)。　　记录用微电极尖端直径约为0.5～1μm，内灌电极液后，电阻为8～16MΩ。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流用膜片钳放大器(CEZ2200，日本光电)放大，放大器探头反馈电阻为10GΩ，低通滤波器滤波频率为3kHz，用四道磁带录音机(RMG5204，Kohden)记录资料。将记录在磁带上的电信号，经带有TL81125接口的125kHzLabmasterDMA数据采集系统和pCLAMP5.5.1版电信号采集程序(AxonInstrum

8、ent，美国)资料输入计算机，用pCLAMP分析程序Fetchan测量通道电流幅度和时程。将测量获得的资料转入pCLAMP的Pstat程序作统计处理。　　1.3资料分析　　数据均用均数±标准差表示。参数比较是在应用方差齐性检验后，用t检验进行分析，P<0.05为差异显著。　　2结果　　2.1单通道电流　　实验中，浴槽液和电极液均使用高钾