线粒体膜电位检测试剂盒说明书

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1、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒一、试剂盒说明：大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位（△ψ）的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。本试剂盒采用JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide)一种阳离子脂质荧光染料作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在

2、，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。本试剂盒可应用于细胞、组织或纯化的线粒体膜电位检测。二、试剂盒组成与配制：组分10assays20assaysJC-1

3、10μl20μl10×IncubationBuffer2.0ml4.0ml三、试剂盒以外自备仪器和试剂：流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器1.5mLMicrotube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、灭菌去离子水四、使用注意事项1．微量试剂取用前请离心集液。2．JC-1避光保存及使用。63．细胞培养的数量不宜超过1×10，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。4．对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间。5．流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而

4、荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。6．组织需先制备单细胞悬液或提取纯化线粒体后方可进行检测，可选用细胞悬液制备试剂盒或线粒体提取试剂盒。五、操作方法1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组和阳性对照组【用适当的凋亡诱导剂（如星形孢菌素，staurosporine），诱导适当时间后经其它检测（如AnnexinV或Caspase3活性）证实确有凋亡产生】，收集细胞；62．用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min），收集不多于1×10的细胞；3．取100μL10×IncubationBuf

5、fer加900μL灭菌去离子水稀释成1×IncubationBuffer，混匀并预热至37℃；4．吸取500μL1×IncubationBuffer，加入1μLJC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液；【因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通过离心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的颗粒，吸取离心后的上清使用，以消除干扰】5．取500μLJC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；6．室温离心（2000rpm，5min）收集细胞，用1×IncubationBuffer洗两次；7．吸取500μL1×IncubationBuffe

6、r重新悬浮细胞；8．荧光显微镜观察或流式细胞仪分析。A．荧光显微镜观察1．滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；用PBS洗涤细胞两次；滴加100μLJC-1工作液，加盖玻片，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；1×IncubationBuffe洗涤1~2遍；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察；正常细胞：双色滤光片观察则为：绿++红++（高绿高红），如在同一滤光片下观察则为黄绿色凋亡细胞：双色滤光片观察则为：绿++红+（高绿低红），如在同一滤光片下观察则为绿色B．流式

7、细胞仪分析用流式细胞仪检测（Ex=488nm;Em=530nm）细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。.正常细胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，凋亡细胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化，试验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和阳性对照组，根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置。六、实验举例：用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37oC，5%CO2培养箱培养4~6h，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1