中国对虾血小板反应素和C型凝集素基因克隆表达和功能研究

《中国对虾血小板反应素和C型凝集素基因克隆表达和功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东大学博士学位论文中国对虾血小板反应素和C-型凝集素基因克隆表达和功能研究姓名：孙允东申请学位级别：博士专业：动物学指导教师：王金星20060413山东大学博士学位论文中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)先天免疫相关基因：C一型凝集素(C-typelectir1)和血小板反应素(Thrombospond．n’TSP)的克隆表达和功能研究摘要中国对虾是我国重要的海产养殖品种，在沿海地区海产品养殖中占有重要的经济地位，养殖对虾不仅给人们的生活提供了美味可口的食品，而且提供了大量的就业岗位，促进了经济的发展。然而，自从上世纪九十年代以来，对虾传染性疾病的流行

2、，特别是病毒的感染给正在蓬勃发展的对虾养殖带来了很大的损失，因而，找到一种有效的控制对虾疾病的诊断和治疗方法已经变得越来越紧迫。解决这一问题除了要考虑对虾合适的养殖环境，对虾的自然生态环境外，还要研究清楚对虾的免疫机理，给对虾疾病的治疗提供一定的理论依据。同其他无脊椎动物一样，对虾中只存在先天免疫，包括细胞免疫和体液免疫。对虾的血细胞在免疫过程中起决定性作用，主要是参与病原的吞噬，形成结节和包被。这些反应与病原微生物的识别，抗菌肽的产生，血淋巴的结合黑化紧密相连，从而构成了对虾严谨而有效的免疫屏障。我们利用一系列的生物化学和分子生物学方法，研究对虾先天免疫相关基因及其功能，试

3、图从～定层面上了解对虾的免疫机制，为对虾疾病的防治提供理论依据，同时为整个生物界免疫系统的研究提供一定的信息。本论文主要是报道了中国对虾两个免疫相关基因：c．型凝集素(C。typelectin)和血小板反应素(TSP)的分予克隆和功能分析，主要结果如下：1中国对虾c_型凝集素的克隆和功能研究凝集素通过对病原微生物细胞表面的糖分子的识别，可以区分“非己”的物质，在生物的免疫应答中起重要作用。我们从中国对虾中得到一种新型的凝集素，命名为Fc—lectin，通过功能域的预测和分析发现，它含有糖分子识别结构域(carbohydrate—recognitiondomains，CRDs)

4、，因此，它是一种C．型凝集素。Fc．1ectin基因全长为571bp，开放阅读框(ORF)为477bp，编码159个氨基酸，其氨基酸序列中含山东大学博士学位论文有CELECT或称糖基识别结构域。通过与其他动物的凝集素序列比对发现，Fc—lectin的CELECT结构域与其它物种的相似性很低，即使与来自另一种对虾(Penaeusmonodon)的凝集素(PmAV)Lh较，其相似性也只有0．289．半定量PCR(RT—PCR)显示，Fc—lectin在正常对虾和刺激对虾的肝胰腺，刺激对虾的胃中有表达，在肝胰腺中，刺激对虾Fc—lectin的表达量远远高于正常对虾，而在正常对虾的胃

5、中没有表达，因此推断，其在对虾的肝胰腺组织组成性表达，但刺激后表达上调，在胃组织是诱导表达。肝胰腺组织原位杂交和荧光免疫组化的结果显示Fc—lectin在刺激对虾的肝胰腺表达量上调，这个结果与半定量PCR的结果是一致的，不同组织WestenBlotting的结果显示Fc．1ectin在刺激对虾的肝胰腺和胃中有杂交信号，这个结果也与半定量P(ER的结果一致，因此推断Fc．1ectin在中国对虾防御病原微生物的过程中有重要作用。构建了凡一lec—pET3a(+)重组质粒，转化大肠杆菌BL21，获得高表达量的重组蛋白，通过管碟法(Oxfordcup)和液体抑制实验等方法测试重组蛋白

6、的抑菌活性和最小抑菌浓度(MIC)，发现其对革兰氏阳性菌和真菌的抑菌能力较强，对革兰氏阴性菌有一定的抑菌能力。细菌结合试验发现Fc-lectin可以结合巨大芽孢杆菌，苏芸金芽胞杆菌，滕黄微球菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌，以及革兰氏阴性菌，大肠杆菌。而不结合革兰氏阳性菌，枯草杆菌和革兰氏阴性菌克雷伯士氏肺炎杆菌。2中国对虾血小板凝集素(ISP)的克隆和表达研究血小板反应素(TSPs)是一个多结构域的钙离子结合细胞外糖蛋白。其结构和功能已经在脊椎动物上进行了广泛的研究，到现在为止已经发现TSPs家族至少包括五个同源基因。其中TSP一1／2／5研究的比较深入，它们在血小板聚合，

7、炎症反应中有重要作用。同时它可以调节伤口愈合和肿瘤生长的细胞分化，因此也被看成一种抑癌基因。我们从中国对虾血细胞抑制消减杂交(SSH)文库中获得数段血小板反应素的cDNA片断，通过3’和5’末端快速扩增(3’RACEand5’RACE)得到血小板反应素的全长序列，命名为Fc—TSP。该基因全长共2908bp，其开放阅读框编码938个氨基酸序列。中国对虾血小板反应素主要包含几丁质结合(ChtBD2)，外皮生长因子山东大学博士学位论文(EGF)，TSP-3功能域和其特征性功能域TSP．C，其与日本对虾(Ma