蛋白二硫键异构酶pdi双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目蛋白二硫键异构酶PDI双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其机制研究研究生姓名周俊松指导教师姓名武艺专业名称医学细拥^物学研究方向血栓与±血2015年5月论文提交日期苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名厂日期:70.^

2、苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在___年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：曰期：i导师签名：曰期：�蛋白二硫键异构酶PD

3、I双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其机制研究摘要摘要研究背景和目的：血栓形成由血小板活化和凝血系统激活两个环节构成。蛋白二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI）家族的原型成员PDI是该家族的主要成员。迄今，已有多项研究应用抗PDI抗体RL90以及PDI抑制剂，报道了PDI在血小板积聚和纤维蛋白形成中发挥重要作用。但是，我们近来发现抗体RL90以及PDI抑制剂对PDI的抑制作用没有特异性。而且，应用新建立的组织特异性PDI基因敲除小鼠模型，我们近一步发现血管内PDI的缺陷导致体内血小板积聚和纤维蛋白形成显著性减弱。这些新的观察结果提示，PDI对

4、血小板活化和凝血系统激活具有双重调控作用。本课题的研究目的是明确血液和血管组织来源的PDI在血小板和凝血系统活化中的作用，解析PDI调控血小板重要受体及凝血蛋白的作用机制，尤其是判定PDI蛋白的功能域。因此，本课题为阐明血栓形成的分子和细胞机制提供新的认识，并揭示新的抗血栓形成的干预靶点。研究方法：本课题综合应用PDI重组蛋白，血小板（Pf4-Cre）特异性PDI敲除小鼠，血管壁-造血系（Mx1-Cre）特异性PDI敲除小鼠，以及通过实验筛选出的PDI全身敲除基础上转入PDI突变基因PDI（ss-oo）小鼠等多种研究工具，从生理性止血，体内血栓形成，体外血小板生理功能（包括聚集、

5、颗粒释放、整合素IIb3的活化）及体外凝血酶生成等四个方面，系统地研究了PDI在血小板和凝血系统活化过程中的作用及其机制。研究结果：（1）RL90抗体能识别重组人PDI蛋白，不识别重组小鼠PDI蛋白，RL90抗体抑制ERp57蛋白酶活性，RL90抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能，RL90抗体抑制PDI敲除血小板的P-selectin表达和整合素IIb3活化；（2）Quercetin-3-O-rutinoside（Rutin）抗体抑制ERp57蛋白酶活性，Rutin抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能；（3）重组PDIss-ss和PDIoo-ss蛋白促进血小板聚集而重组PD

6、Ioo-oo和PDIss-oo蛋白抑制血小板聚集,PDIoo-oo蛋白延长小鼠尾巴出血时间（3.601±0.4068v.s.7.717±1.3,p=0.0059）；（4）PDI的缺失明显抑制血小板聚集（p<0.001）、整合素IIb3活化（p<0.05）和-颗粒释放（p<0.05），PDIoo-ss蛋白补偿PDI缺乏血小板的聚集功能（p=0.007），β3的缺陷抑制重组PDI蛋白和血小板的结合（p=0.0162），血小板PDI的缺失明显延长小鼠尾巴出血时间（3.369±0.6597v.s.I摘要蛋白二硫键异构酶PDI双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其机制研究8.00±1

7、.013,p=0.0003）和FeCl3诱导的颈动脉闭塞时间（4.914±0.3113v.s.8.846±0.8364，p<0.0001）；（5）内皮-造血系PDI的缺乏不仅明显抑制血小板积聚(p<0.0001)，还抑制纤维蛋白形成（p=0.033），PDI重组野生型蛋白促进组织因子介导的凝血酶的生成（p=0.0047），PDI重组突变蛋白抑制活化血小板依赖的凝血酶的生成（p<0.0001）；（6）全身PDI基因敲除小鼠以及全身敲除基础上转入PDI第一活性位点突变基因小鼠（PDI