磺胺氯吡嗪钠化学发光免疫分析方法的建立

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1、密级：论文编号:中囯农此科学院学位论文磺胺氯吡曉钠化学发光免疫分析方法的建立TheEstablishmentofEnzymeEnhancementChemiluminescenceImmunoassayforSulfachlorpyrazinesodium硕士研宄生：张梦指导教师：王权研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研宄所研宄生院2015年5月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或

2、撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年r月如曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，g卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名：时间：年J：月和日时间：年r月y日导师签

3、名：1中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目磺胺氯吡嗪钠化学发光免疫分析方法的建立论文作者张梦专业领域兽医研究方向指导教师王权培养单位(研究所、中心）I•医研翻姓名职称单位专业^,.縣)封文海教授中国农业大学兽医评阅涂亚斌副研究员哈尔滨兽医研究所兽医/人答辩江善祥教授南京农业大学基础兽医学主席华修国教授上海交通大学预防兽医学李绍顺教授上海交通大学兽药学答薛飞群研究员上海兽医研究所兽药学<辩费陈忠研究员上海兽医研究所兽药学委i1贝会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间地点2015年5月25日，上海兽医研究所Sec

4、recy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheEstablishmentofEnzymeEnhancementChemiluminescenceImmunoassayforSulfachlorpyrazinesodiumM.S.Candidate：MengZhangSupervisor：Prof.QuanWangDegree：MasterofVeterinaryScienceSpecialty:VeterinaryMedicineMay2015摘要磺胺氯吡嗪

5、钠（sulfachlorpyrazinesodium，SPZ）是磺胺类药物的一种，在兽医临床上用来治疗家禽球虫病。若大剂量使用或不遵守休药期规定，药物易在动物体内蓄积，威胁人类健康。免疫学检测方法作为兽药残留大规模检测的主要方法，具有特异性强，灵敏度高等特点。目前国内外关于SPZ残留的酶联免疫检测方法（ELISA）的报道较少，未见关于SPZ的化学发光免疫分析（CLIA）检测方法的报道。本文制备了SPZ的单克隆抗体，在此基础上建立CLIA方法；同时对磺胺药物多残留快速检测技术进行探索，合成了药物的母核抗原-磺胺噻唑（TS）并制备其

6、多克隆抗体，分别用ELISA方法和CLIA方法对抗体进行鉴定。1、SPZ单克隆抗体的制备及鉴定。本实验通过重氮化方法制备了完全抗原SPZ-OVA，免疫小鼠4次后，选取血清抗体效价较好的小鼠脾细胞进行细胞融合。经过筛选并将阳性克隆按有限稀释法亚克隆3次，得到稳定分泌抗体的细胞株。将细胞株扩大培养后，腹腔注射小鼠制备腹水。将腹水单克隆抗体D9纯化后通过间接ELISA确定包被原最佳浓度为0.01μg/mL，单抗的工作浓度为1：4×105，在最佳抗原抗体工作浓度下进行ci-ELISA实验，建立标准曲线，得到曲线线性方程为y=-0.336

7、9x+1.347，R2=0.994，计算得抗体半数抑制浓度（IC50）为326ng/mL；与其他测试药物的交叉反应小于5%，表明单抗特异性良好。2、SPZ化学发光免疫检测（CLIA）方法的建立。在单克隆抗体MabD9的基础上建立SPZ的CLIA方法，在0.02-4μg/mL的范围内，SPZ浓度的对数值与相对发光值呈线性关系，线性方程为y=-0.3602x+1.2874，R2=0.981，IC50值为151ng/mL；标准曲线的批内变异系数为7.02%，批间变异系数为8.5%；鸡肉样品最低检测限为36.3ng/g，样品添加回收率在

8、75%-85%之间。3、磺胺类药物族特异性抗体的制备。首先合成磺胺母核结构TS，然后用碳二亚胺（EDC）法合成免疫原TS-BSA，将其免疫小鼠后，对抗血清进行筛选，得到两只小鼠血清效价分别为1：2.56×105和1：1.28×105；选用效价高的小鼠血清进一步检