新型可塑形同种骨修复材料的制备及相关研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文新型可塑形同种骨修复材料的制备及相关研究PreparationandStudyonaNovelMalleableAllogenicBoneReconstructiveMaterial课题来源：中国辐射防护研究院青年科技基金(YQl20807)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院张乃丽李宝兴人体解剖与组织胚胎学学术型博士基础医学院答辩委员会主席原林教授答辩委员会委员黄文华教授王志强教授赵亚平主任医师谢满廷研究员2013年4月1日广外f燃黜博士学位论文新型可塑形同种骨修复材料的制备及相关研究博士研究生：张乃丽指导教师：李宝兴

2、摘要第一章脂肪酶用于骨移植材料脱脂的可行性研究目的：应用脂肪酶对骨组织进行脱脂，检测脱脂处理骨材料的脂肪含量、表面结构、对MC3T3．E1小鼠成骨前体细胞增殖影响、细胞相容性及组织相容性，评价脂肪酶用于骨移植材料脱脂过程的可行性。方法：取新鲜猪股骨，置于．76℃深低温冰箱中冻存两周，去除软组织，锯成骨条或骨小块，超声清洗48h。平均分成四组进行脱脂处理，分别为：脂肪酶处理组：40℃条件下，PH=10的1％浓度的脂肪酶溶液中浸泡4h；NaHC03／Na2C03处理组：PH=10的NaHC03／Na2C03溶液中浸泡4h；丙酮处理组(阳性对照)：丙酮溶液中浸泡24h，再用

3、无水乙醇浸泡36h去除丙酮；纯化水处理组(阴性对照)：在纯化水中浸泡4h。脱脂过程结束后再超声清洗12h，冷冻干燥。索式提取法浸提各组骨材料，根据浸提前后重量差计算各组骨材料中脂肪含量。扫描电子显微镜观察各组骨材料表面结构，组织学切片，HE和Masson三色染色，观察材料内部结构。取各组骨材料，辐照灭菌，H．DMEM培养基为浸提介质，按0．29骨材料／ml培养基比例，在37℃条件下浸提72h，制备各组骨材料浸提液，以H．DMEM培养基为试剂对照、无毒性聚乙烯片为阴性对照、苯酚为阳性对照。取指数生长期MC3T3．E1小鼠成骨前体细胞调整浓度为1X104个／ml，按100

4、uL／孔接种到96孔细胞培养板，培养箱中培养24h，换用各组浸提液继续培养。分别在浸提液摘要培养的第1，4，7d，每孔加入CCK．8试剂10laL，培养箱中孵育6h后，酶标仪检测各孔吸光度值，计算细胞增殖率并评价细胞毒性级别。取各组骨材料，置于6孔培养板，取指数生长期MC3T3．E1小鼠成骨前体细胞，并调整细胞浓度至2×105个／ml，按每块材料50011L细胞悬液接种到各组骨材料，培养箱内培养3h后，加培养基至足量，培养7d后，取出骨材料．细胞复合物，扫描电子显微镜观察细胞在各组骨材料上的生长情况。取各组骨材料分别埋入大鼠脊柱两侧皮下，分别于术后的第1，4，12周随

5、机选取3只动物处死，取材，组织学切片，HE染色，光镜下观察组织学变化。结果：脱脂处理后，脂肪酶、丙酮脱脂及Na2C03／NaHC03处理组骨材料表面清洁，无油渍，纯化水浸泡骨材料表面可见油渍。辐照灭菌后，脂肪酶和丙酮处理组骨材料颜色洁白，Na2C03／NaHC03处理组骨材料呈微黄色，纯化水清洗的骨材料颜色更黄。脂肪酶处理组骨材料脂肪含量(0．46+0．16％)与丙酮处理组(1．11+0．13％)相近，差异无统计学意义(P=0．065)，均低于Na2C03／NaHC03处理组(3．46-1-0．69％)，差异有统计学意义(P<0。001)；纯化水组骨材料脂肪含量(8．

6、88±O．18％)高于其他组别，差异有统计学意义(P<0．001)。扫描电镜观察，脂肪酶及丙酮处理组骨小梁表面结构保持完整，仅有少量细胞碎片附着；Na2C03／NaHC03处理组骨材料表面有小脂滴及细胞碎片；纯化水处理组骨材料可见大量脂肪滴覆盖在骨小梁表面。组织学观察，脂肪酶处理组在材料浅层及中心部位骨小梁间隙内均未见残留骨髓组织及细胞碎片；NazC03／NaHC03处理组骨材料深层的骨小梁间隙内可见少量残留细胞碎片；丙酮处理组骨材料在中心部位偶见细胞碎片；纯化水处理组骨材料骨小梁间隙内可见残留骨髓组织，部分残留组织连接成片。Masson三色染色显示各组骨材料的骨小梁

7、中的胶原纤维排列有序，未见胶原纤维损伤断裂。对MC3T3．E1小鼠成骨前体细胞的细胞毒性评级结果显示，脂肪酶处理组及丙酮处理组骨材料在第1，4，7d的细胞毒性为0级或1级；NazC03／NaHC03处理组骨材料在各个时间点均为1级；纯化水处理组骨材料的细胞毒性为2～4级。扫描电镜下观察骨材料与MC3T3．E1细II博士学位论文胞的相容性，结果显示，MC3T3．E1细胞在脂肪酶及丙酮处理组骨材料骨小梁上附着生长，呈梭形或多角形，几乎完全融合，覆盖骨小梁；Na2C03／NaHC03处理组骨材料上仅有部分区域聚集成片生长，但保持梭形或多角形形态；在纯化水处