mir-29a促进结直肠癌远处转移的机制研究

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1、汤文涛miR．29a促进结直肠癌远处转移的机制研究中文摘要第一部分miR．29a促进结直肠癌远处转移的研究目的和意义：远处转移是结直肠癌(CRC)患者死亡的主要原因。肿瘤远处转移是一个复杂的多步骤过程，包括原发肿瘤的生长，血管生成，癌细胞侵袭，渗入血管或淋巴管，外渗到远处的器官以及转移瘤的定居和生长。大量研究证实miRNA在CRC远处转移过程中起重要作用。本实验分析miR一29a在CRC患者临床标本中的表达及miR．29a对CRC细胞恶性表型的影响。评估miR一29a在CRC患者诊断或预后判断的应用价值。研究方法：运用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测68例CR

2、C患者肿瘤组织中miR一29a的表达，并分析miR一29a表达水平与临床病理特征的关系。然后将miR一29amimics和antmiR一29a分别转染CRC细胞系LoVo和HCT-116。运用transwell小室分析miR一29a对CRC细胞侵袭的影响，运用蛋白质印迹(Westernblot)检测基质金属蛋白酶2和9(MMP2／9)蛋白的表达。最后，利用慢病毒技术构建miR．29a稳定转染的LoVo细胞株，建立裸鼠CRC肝转移模型，体内水平分析miR．29a对CRC远处转移的影响。研究结果：qRT-PCR结果显示miR．29a表达水平与CRC肝转移正相关，而与其它临床病理特

3、征均无显著显著相关性。细胞侵袭实验显示miR-29amimics促进LoVo和HCT-116细胞的侵袭，而anti—miR．29a抑制LoVo和HCT-116细胞侵袭。Westernblot结果显示miR一29amimics促进MMP2和MMP9蛋白的表达，而antmiR一29a抑制MMP2和MMP9表达。裸鼠CRC肝转移模型显示miR一29a促进CRC体内远处转移。结论：miR。29a表达水平与CRC远处转移正相关。miR一29a促进CRC细胞侵袭和远处转移，是CRC潜在的癌基因。扬州J人学硕士学位论文2第二部分miR-29a靶基因的鉴定I删剃目的：确定CRC中miR一29

4、a的靶基因，并研究miR．29a如何通过其靶基因参与CRC的远处转移。研究方法：我们前期研究已筛选出CRC中miR．29a可能作用的靶点，克隆其3’UTR，构建靶基因3’UTR野生型报告基因质粒。然后将重组质粒中miR一29a的结合位点反向突变，构建靶基因3’UTR突变型报告基因质粒。运用荧光素酶实验分析miR．29a对靶基因调控作用。运用westernblot技术在CRC细胞中验证miR．29a对靶基因的调控作用。运用免疫组织化学(IHC)技术检测靶基因在CRC组织及配对的非癌组织(NCT)中的表达，并运用qRT-PCR检测靶基因高低表达两组间miR一29a的表达，分析靶基

5、因表达与miR一29a之间的相关性。最后运用transwell小室分析miR．29a所诱导的CRC细胞侵袭是否主要通过下调靶基因来实现的。研究结果：根据软件预测和查阅文献，筛选出KLF4可能为miR．29a靶基因。荧光素酶实验显示miR一29amimics和ani．miR．29a分别显著下调或上调KLF43’UTR野生型报告基因荧光素酶活性，但对KLF43’UTR突变型报告基因荧光素酶活性无明显影响。Westemblot结果进一步证实miR．29a反向调控KLF4蛋白表达。IHC结果显示与配对的NCT相比，KLF4蛋白在64％(54／85)的CRC肿瘤组织中表达下调，并且KL

6、F4蛋白表达与miR一29a表达水平呈显著负相关。细胞侵袭试验证实KLF4过表达能够阻碍miR一29a所诱导的促进侵袭作用，而KLF4siRNA能逆转anti．miR一29a所导致的侵袭下调。研究结论：KLF4是miR．29a的靶基因，miR一29a可能是通过下调KLF4表达促进CRC远处转移。关键词：结直肠癌；miR一29a；远处转移；侵袭；KLF4汤文涛miR．29a促进结直肠癌远处转移的机制研究3PARTIAbstractTheroleofmiR-29aondistantmetastasisofcolorectalcancerobjectiveDistancemetas

7、tasisisamajorcauseforthedeathofcolorectalcancer(CRC)patientsThereisincreasingevidenceofmiRNA'sinvolvementinCRCmetastasis．Inthisstudy,weanalyzedtheexpressionlevelofmiR一29ainCRCtissuesandtheinfluenceofmiR_29aonmalignantphenotypeofCRCinordertoevaluatetheapp