逆转座子atrl诱导元帅系苹果短枝变异分子机理的初步研究

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1、摘要前期研究表明逆转座子atr1参与了苹果元帅系的短枝变异，为揭示其变异机理，本研究借助已获得的atr1-LTRs和IPCR技术分离了atr1部分序列；利用IRAP-PCR在元帅系短枝变异品种中分离出一条特异性片段，并以此为切入点，在“元帅”短枝变异品种中获得了特异片段的部分侧翼序列，序列比对结果表明四个短枝变异品种中特异性片段相同，本研究为揭示逆转座子诱导苹果短枝变异机理提供了基础。1、逆转座子atr1-LTRs部分侧翼序列。根据前期获得atr1-LTRs的500bp片段，利用IPCR分离其侧翼序列。借助atr1-LTRs设计两对反向引物，利用限制性内切酶HindⅢ对“玫瑰红”基因组DN

2、A进行充分酶切后，用T4连接酶将酶切片段连接成环作为PCR模板。两轮巢式PCR后，测序得到一条片段大小为1896bp。将该片段与先前的atr1-LTRs片段拼接后设计验证引物，在“玫瑰红”基因组DNA中进行扩增，最终测序得到一条2124bp的片段。分析表明其中包含了“逆转录酶基因（RT）的部分片段、RNaseH和3’-LTR部分及其侧翼序列”。2、基于atr1的苹果元帅系短枝变异品种特异性片段的分离。以苹果“元帅”及其短枝变异品种“华帅1号”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“玫瑰红”的基因组DNA为模板，利用atr1-LTRs设计引物，根据优化的IRAP-PCR体系和程序，扩增出“元帅”及其短

3、枝变异品种指纹图谱，并分离出一条差异条带。测序结果中，“华帅1号”得到两条长度分别是809bp和758bp的特异片段，命名为Hs1和Hs1’，“矮红”、“奥勒冈矮生”和“玫瑰红”品种分别得到了一条长度为809bp的特异片段，命名为Ah1、Alg1和Mgh1。在此基础上，每条特异片段设计一条较长的引物，分别在“元帅”及其短枝变异品种进行验证，成功将IRAP标记转化为SCAR标记。3、TAIL-PCR分离元帅系短枝变异品种中特异片段的侧翼序列。先根据Mgh1设计三条巢式特异引物，与简并引物相结合，优化了三轮PCR扩增体系和程序，得到测序结果后与Mgh1序列拼接并设计验证引物，在“元帅”及其短枝

4、变异品种扩增，得到特异片段Hs2、Ah2、Alg2和Mgh2。再根据Hs2设计三条巢式特异引物，与简并引物相结合，经过三轮PCR扩增，得到测序结果后与Hs2序列拼接并设计验证引物，在“元帅”及其短枝变异品种扩增，最终得到特异片段Hs3、Ah3、Alg3和Mgh3。关键词：苹果逆转座子IRAP标记反向PCR热不对称交错PCRIAbstractPartialsequencesofTy1-copial-likeretrotransposonatr1inapplegenome,whichcouldbeactivatedunderstressconditions,wereisolatedusingt

5、helongterminalrepeatsequenceinatr1(atr1-LTRs)byIPCRtechnique.ThespecialfragmentswereisolatedinDeliciousclonesspursportsbyIRAP-PCR,andThepartialflankingsequencesofwhichwereamplifiedinDeliciousclonesspursports.Thealignmentresultindicatedthatitissameforthespecialfragmentsinthefourspursports.Theresear

6、chlaidthefoundationonthemechanismthatretrotransponsonsinducedthemutationofspurtype.1.Theisolationofpartialflankingsequencesofretrotransponsonsatr1-LTRs.Theflankingsequencesofatr1-LTRswereisolatedusingtheprimerswhichweredesignedbasedona500bpfragmentofatr1-LTRsbyIPCRtechnique.Afterenzymedigestionade

7、quatelybyrestrictionenzymesHindⅢin‘Meiguihong’genomeDNA,self-loopedandligatedweremadewithT4ligase,thenthereactionproductswereusedasthetemplatesforPCR.A1896bpfragmentwasamplifiedaftertwocirclesofnestedPCR.Finally,