苏云金杆菌辅助蛋白p19对杀虫晶体蛋白cry11aa表达的影响

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1、!"卷#期微生物学报!（"#）：#&#’#&($%%"年"月!日!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$!)*+,$%%"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!苏云金杆菌辅助蛋白!"#对杀虫晶体蛋白$%&""’(表达的影响/，$/，#///"师永霞，曾少灵，袁美妗，孙钒，庞义（/中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室广州&/%$(&）（$南方医科大学基因工程研究所广州&/%&/&）（#深圳出入境检验检疫局动植中心深圳&/2%/%）摘要：苏云

2、金杆菌以色列亚种的!/-基因、"#$//D5基因和!$%基因位于同一操纵子上，据推测辅助蛋白E/-可能与FGA//D5蛋白的晶体化相关。本研究利用穿梭载体HI0#/%/构建了两个重组质粒HI?A/和HI?A#，两质粒均携带"#$//D5基因，但后者完全缺失了"#$//D5基因上游的!/-基因。将重组质粒电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株!J(中进行蛋白表达，KLK3ED.7结果表明在!J（(HI?A/）和!J（(HI?A#）中均能检测到正常表达的FGA//D5蛋白，但单位体积培养液的FGA//D5蛋白在辅助蛋白E/-存在时的表达量明显高于其单独表达的表

3、达量；透射电镜观察显示两菌株中的FGA//D5蛋白形成了大小相近、形状相似的双梯形晶体；另外，生物测定结果表明重组菌株!J(（HI?A/）和!J（(HI?A#）对三龄致倦库蚊的杀虫活性没有显著性差异。该现象说明辅助蛋白E/-的缺失对FGA//D5蛋白的晶体形成和杀蚊活性没有影响，但E/-作为分子伴侣在一定程度上帮助提高了FGA//D5蛋白的表达水平。关键词：苏云金杆菌；辅助蛋白E/-；晶体蛋白FGA//D5；生物测定中图分类号：J(2"文献标识码：D文章编号：%%%/3"$%-（$%%"）%#3%#%&苏云金芽孢杆菌（%&"’(()*+,)#’

4、-.’/-*’*，MN）在芽因共同组成"#$//D5操纵子，已有的研究证实辅助孢生长阶段能产生具有专一杀虫活性的晶体蛋白蛋白E$%不是FGA//D5蛋白在MN中高水平表达和晶［-］（O+:,?N9?9>51FGA:N51EGCN,9+:，OFE:），且对人、畜、植物体形成所必需的。辅助蛋白E/-蛋白的氨基酸组［/］等非目标生物十分安全，因此被广泛用于鳞翅目成中富含半胱氨酸残基，能有效形成二硫键，这个特［$］的多种作物害虫、双翅目的蚊虫以及鞘翅目的马铃点与OFE:晶体化密切相关，因此有人估计!/-基［$，/%’/$］薯甲虫等的生物防治。因很可能是FGA

5、//D5蛋白结晶的根本原因，苏云金杆菌不同OFE:的晶体化机制不尽相同。但是至今仍没有将!/-基因完全缺失的具体实验能分子量约为/#&PL5的FGA类蛋白（FGA/DQ类除外），够证明以上的推论。如FGA/D和FGA!D，由于具有富含半胱氨酸的F3端本研究将位于"#$//D5操纵子中、"#$//D5基因半部，能自主形成双硫键，最终促进典型双金字塔型上游的!/-基因完全缺失，构建了重组质粒HI?A#，［$’!］晶体的形成；FGA#类蛋白是通过分子间盐桥自并电激转化至MN晶体缺陷型菌株!J(中进行［!］主形成晶体。还有一类蛋白，如FGA$、FGA//D和

6、FGA//D5蛋白的表达，分析了辅助蛋白E/-对FAN/D，由于缺乏如FGA/类蛋白中富含半胱氨酸的FGA//D5的表达量、形成的晶体形状、晶体大小和杀F3端半部，必须依靠某些分子伴侣（或称辅助蛋白）蚊活性的影响。［!’2］的作用才能形成晶体。所谓MN的分子伴侣，是"材料和方法指一些与毒素蛋白晶体化相关的小分子量蛋白，它们本身不具有杀虫活性，但能帮助某些杀虫晶体蛋")"材料白正常表达和形成晶体，这种作用有时候甚至是必")")"菌株和质粒：表/为本研究涉及的菌株和质需的。到目前为止，已在MN中发现了一些具有特殊粒，其中大肠杆菌（2*",/#’",’&"

7、0(’）和MN分别在#(R功能的辅助蛋白基因，如!$%，!/-，0#1/，0#1$等。和#%R培养，使用的抗生素浓度分别为氨苄青霉素G"#$//D5启动子区、!/-基因、"#$//D5基因和!$%基（D8H）/%%!ST8U和红霉素（7G8G）$&!ST8U。基金项目：国家“-(#项目”（.$%%%%/"$%-）；广东省自然科学基金研究团队项目资助"通讯作者。0,1：2"3$%32!//#2"%；456：2"3$%32!%#(!($；738591：/:/$;<:*=,>*=?+作者简介：师永霞（/-("@），女，河南省安阳人，博士研究生，研究方向为杀

8、虫微生物及基因工程。738591：:A6%2/(;A5BCC=?C8=?+收稿日期：$%%&3%(3/2；接