生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略硕士论文

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1、博士学位论文生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略OPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONFORBIODEMULSIFIER-PRODUCINGBACTERIUMANDITSREGULATIONSTRATEGIES李旭哈尔滨工业大学2012年6月国内图书分类号：X703.5学校代码：10213国际图书分类号：628.3密级：公开工学博士学位论文生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略博士研究生：李旭导师：马放教授申请学位：工学博士学科：环境科学与工程所在单位：市政环境工程学院答辩日期：2012年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学Classifi

2、edIndex:X703.5U.D.C:628.3DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringOPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONFORBIODEMULSIFIER-PRODUCINGBACTERIUMANDITSREGULATIONSTRATEGIESCandidate：LiXuSupervisor：Prof.MaFangAcademicDegreeAppliedfor：DoctorofEngineeringSpeciality：EnvironmentalScienceandEngineering

3、Affiliation：SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineeringDateofDefence：June,2012Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology摘要摘要为满足“资源节约型、环境友好型”社会建设和绿色工业发展对绿色净水剂的需求，生物破乳剂作为一种高效、低毒、环保的绿色净水剂，成为破乳剂领域研究的新热点。在高含水原油乳状液以及其它工业乳状液副产品的处理和处置中，应用生物破乳剂替代大量使用的化学破乳剂，对提高乳状液脱水率，降低环境污染风险具有深远意义。但是，

4、生物破乳剂的实际应用进程受到破乳剂产生菌代谢过程不稳定、破乳有效成分复杂及缺少大规模发酵生产经验等问题的制约。基于此，开展破乳菌筛选方法；菌种破乳效能强化；粗产品分离与鉴定；发酵工艺优化及产破乳剂相关蛋白质功能解析等方面的研究，将为生物破乳剂的大规模生产、推广和应用奠定良好基础。将可用于间接表征生物破乳剂破乳效能及破乳菌初筛的6种生物表面活性剂检测方法与破乳试验相结合，提出破乳菌筛选原则，构建高效筛选模式。确定了高效破乳菌(24h排油率≥90%)的判断依据：发酵液表面张力≤40mN/m或细胞表面疏水性(MATH)≥50%。筛选得到7株高效破乳菌，经16SrDNA鉴定分属于芽孢杆

5、菌属(Bacilllussp.)和戈登氏菌属(Gordoniasp.)，实验室编号分别为LXH-1、LXH-2、LXH-3、LL1、LL-1、LL-2和LL-3。以生物破乳剂产生菌XH1为研究对象，改进破乳菌复壮方法，其核心是通过烃类物质-液体石蜡为底物排除负变细胞，调节菌株的破乳活性；改进的复壮方法可成功将菌株XH1的表面活性、破乳功能等特性恢复至原始水平，效果优于常规复壮。研究表明烃类物质-液体石蜡对菌株XH1合成破乳有效组分具有刺激和促进作用，利用液体石蜡预先刺激强化菌种，再经生产培养基扩大培养，获得的生物破乳剂可将破乳半衰期t1/2从16h缩短为2h。根据胞外蛋白破乳比

6、活性、细胞表面疏水性等相关试验结果，初步分析液体石蜡强化促进菌株XH1破乳特性的作用机制。菌株XH1经液体石蜡强化后，破乳有效组分主要分布于上清液和附着在菌体表面。分离得到生物破乳剂粗产品，产量为2.01g/L，4mg的排油率(24hR.D.)>93%。利用可见-紫外光谱、红外光谱和薄层层析(TLC)确定粗产品主要功6能组分为蛋白质和脂肽类物质；平均分子量为2.59×10Da。并从中粗提得到脂肽类物质的量为0.08±0.01g/g(24hR.D.:65.3%)；破乳活性蛋白复合物可由饱和度25%，45%的(NH4)2SO4粗提得到，产量为0.36±0.02g/g(24hR.D.

7、:67.4%)。利用SDS-PAGE电泳和质谱技术确定疏水蛋白质OxalateDecarboxylase为一种破-I-哈尔滨工业大学工学博士学位论文乳有效蛋白质。为了提高生物破乳剂的产率，采用响应面法(RSM)确定最优培养基组成为：8.5g/L葡萄糖、3%(v/v)液体石蜡、15g/L磷酸盐(K2HPO4&KH2PO4)、1.5g/L酵母膏和3.36g/L氯化铵；与优化前相比排油率(24h)提高了35.5%，破乳剂粗产品产量提高了1倍。进一步确定最佳发酵条件为：培养温度29℃、摇床转速200