peg介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法

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1、·PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法   1.B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。 2.准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。 3.取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。 4.配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。 5.将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。 6.酶解液过100-200目的筛子

2、，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60g，15min，brake设为4-5。 7.弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100g，1min，brake设为4-5。 8.弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。 9.23℃，100g，1min，brake设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5mlMaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。） 10.取约10-20ug质粒于1.5mlEP管中，加100ul步骤9中的原生质体。用200ul枪头

3、（剪去前端）轻柔混匀。 11.加入110ulPEG/Ca溶液，轻柔混匀。放置20-30min。 12.加入0.44mlW5溶液，来回颠倒混匀。23℃，100g，1min，brake设为4-5。 13.弃上清，加100ulW5，混匀。加900ulW5，混匀。 14.上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。 15.荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。   SolutionRecipes Enzymesolution1ml15％cellulaseR10(RSistoostron

4、g)1ml4.5％macerozymeR10(YakultHonsha,Tokyo,Japan)1.09gmannitol1ml0.3MKCl1ml0.3MMES,pH5.7Heattheenzymesolutionat55oCfor10min(toinactivateproteasesandenhanceenzymesolubility)andcoolittoroomtemperaturebeforeadding1ml0.15MCaCl21ml0.75mMβ-mercaptoethanol1ml1.5%BSA  PEGso

5、lution(40%,v/v)1gPEG4000(Fluka,#81240)**VeryImportant!!0.75mlH2O0.625ml0.8Mmannitol0.25ml1MCaCl2  W51000ml154mMNaCl9.0g125mMCaCl218.4g5mMKCl0.37g5mMglucose0.9g0.03%MES0.3gpHto5.8withKOHautoclave20minutesin125bottles   MaMgsolution100ml15mMMgCl21.5ml1MMgCl20.1%MES0.

6、1g0.4Mmannitol7.3gpHto5.6withKOHautoclave20minutesin125mlbottles  References1.Sheen,J.2002,AtransientexpressionassayusingArabidopsismesophyllprotoplasts.http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/2.Doelling&Pikaard.1993,TransientexpressioninArabidopsisthalianaprotopl

7、astsderivedfromrapidlyestablishedcellsuspensioncultures.PlantCellReports12:241-244EnzymesolutionPrepare20mMMES(pH5.7)containing1.5%(wt/vol)cellulaseR10,0.4%(wt/vol)macerozymeR10,0.4Mmannitoland20mMKCl.Warmthesolutionat55℃for10mintoinactivateDNAseandproteasesandenha

8、nceenzymesolubility.Coolittoroomtemperature(25℃)andadd10mMCaCl2,1–5mMβ-mercaptoethanol(ptional)and0.1%BSA.▲CRITICAL:Additionof1–5mMβ-mercaptoetha