氟中毒肾损伤时stc1、ucp2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文氟中毒肾损伤时STC1、UCP2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究姓名：张永春申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：吴小候201205重庆医科大学博士研究生学位论文氟中毒肾损伤时STCl、UCP2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究摘要长时间、过量的氟摄入会导致机体组织和脏器的损伤，并特征性的引起氟斑牙、骨关节畸形、骨质疏松、骨关节硬化。该类疾病均由氟中毒导致，并统称为地氟病。地氟病是一种覆盖各大洲，影响数千万人的地球化学性疾病。近15年来，氟中毒对非骨相系统的影响正逐渐成为学界的研究热点，其中又因为肾脏是机体排氟的最主要脏器和其本身就是氟中毒的靶器官，

2、而使肾脏成为了非骨相系统研究中的重点。线粒体是氟离子攻击细胞的核心靶点，肾脏作为富含线粒体的脏器，已在前人的大量研究中证实了氟中毒能使肾小管上皮细胞中线粒体的结构，功能活性受到严重影响，并与染氟剂量存在剂量．程度相关性，但是，氟中毒影响肾小管上皮细胞线粒体的毒理机制尚不明确，因此，本课题选择从线粒体层面对氟中毒肾损伤进行相关机制的研究。斯钙素蛋白1(Stanniocalcml，STCl)是一种调节细胞钙离子平衡的糖蛋白激素，在人体的许多脏器都有表达，高表达于肾脏、前列腺、子宫和甲状腺。STCl主要通过自分泌和旁分泌起作用，并作用于细胞的线粒体，调节钙及磷酸盐的代谢。近年来STCl的其他功能

3、逐渐被发现，相关研究显示，STCl与损伤修复、细胞信号转导、血管再生、类固醇生成、肌肉和骨的生长、肿瘤等相关。最新的研究显示，STCl可重庆医科大学博士研究生学位论文以通过调节钙离子的含量致使细胞第二信使功能减弱，并通过增高解偶联蛋白2(UCP2)的表达来抑制线粒体膜电位降低和减少超氧化物的产量，这与细胞ATP的生成、NADH和FADH2平衡、ROS产量等息息相关。UCP2定位于线粒体内膜，是一种调控线粒体内外膜电化学梯度的解偶联蛋白，占线粒体膜蛋白含量的0．01．0．1％，在正常情况下，UCP2并没有介导线粒体膜质子漏，亦未对线粒体内外膜的电位差产生过多影响。但在细胞受到攻击或刺激时，特

4、别是对能带来氧化应激、脂质过氧化损伤的刺激，可促使UCP2介导线粒体内外膜间发生质子漏，从而降低线粒体内外膜的膜电位差，使ROS产量减少、超氧化物产量减少等，并以之拮抗相关损伤给细胞、组织带来的损害。UCP2介导线粒体膜电位差改变要借助于[Ca2+】及[Ca2+]相关通道蛋白才能完成，且细胞钙含量的改变也能促使UCP2的表达发生改变，近年来的研究发现，钙离子与UCP2的关系不仅在机体抵御外界刺激时才能发生，而且在各种肿瘤的发生、发展过程中，UCP2可以作为一种肿瘤标志物，通过调节钙离子含量及钙离子相关通道影响肿瘤细胞的各种异质化功能。本课题从线粒体层面对氟中毒肾损伤的分子机制进行研究，紧扣

5、目前氟中毒肾损伤研究的薄弱点；以肾小管上皮细胞线粒体解偶联蛋白2和斯钙素蛋白1作为研究对象，以钙离子作为干扰条件，探讨氟中毒肾损伤时UCP2、STCl是否参与了氟中毒肾损伤过程，是否在参与过程中受到钙离子的影响，初步研究UCP2、STCl在氟中毒肾损伤机制中的作用；本研究先进行动物实验，观察氟中毒大鼠肾脏中UCP2、4重庆医科大学博士研究生学位论文STCl的改变，线粒体解偶联功能的改变和氧化应激指标的改变，以及这些改变与肾组织中[Ca2+】含量的关系，再给予大鼠高钙饮食，观察UCP2、STCl表达出现的变化，高钙与该变化的关系；构建重组UCP2真核表达质粒质粒，使肾小管上皮细胞(HK2)高

6、表达UCP2，再以氯化钙侵染细胞培养基，研究不同剂量氟化钠干扰高表达UCP2的肾小管上皮细胞时，细胞生长情况、线粒体解偶联相关指标的变化，此类变化被高钙环境干预后出现的改变，以及UCP2、STCl、[Ca2+]在氟中毒肾损伤中的关系；该实验从亚细胞器水平对氟中毒肾损伤机制进行研究，选择了与[Ca2+]、氧化应激密切相关的UCP2、STCl作为研究靶点，实验设计符合逻辑，该实验的结果可为以后从线粒体水平研究氟中毒肾损伤的分子机制提供理论和实验基础。重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分氟中毒大鼠肾脏STCl、UOP2的表达及肾细胞内[Ca2+]含量的变化目的：构建符合实验需要的氟中毒模型，检

7、测UCP2、STCl及钙、磷离子在氟中毒大鼠肾损伤中的变化，探讨UCP2、STCl在氟中毒肾损伤机制中的作用及与钙离子的关系。方法：24只雄性SD大鼠按体重平均分为4组：对照组、低氟组、中氟组、高氟组；对照组采用生理盐水注射，实验组按体重比分别给予5mg／kg、10mg／kg、20mg／kg的NAF腹腔注射，每48小时注射1次，蒸馏水及常规鼠饵自由饲食；建模16周后，取左肾包埋固定，行免疫组化检测UCP2、STCl的蛋白