sirna抑制ho-1表达以治疗新生期高胆红素血症的研究

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1、siRNA抑制HO-1表达以治疗新生期高胆红素血症的研究摘要新生儿黄疸是新生儿期临床常见病症，由胆红素产生和排泄失衡所致，发生率较高，约占新生儿的2/3。胆红素对神经系统有损害，严重黄疸者可引起胆红素中毒性脑病，约占新生儿黄疸的0.5~2％，造成儿童智力障碍甚至死亡，有很高的致死率或致残率。血红素加氧酶（HemeOxygenase,HO）是血红素代谢为胆红素的限速酶，其中HO-1可被多种因素诱导。本课题先通过RNA干扰技术在体外BRL细胞水平特异下调HO-1基因的表达，探讨通过降低HO-1表达以阻断胆红素产生；然后用有效的siRNA注射新生鼠黄疸模型降低胆红素生成

2、，以期寻找出一条新的早期防治新生儿高胆红素血症及胆红素中毒性脑病新的有效途径。针对大鼠HO-1基因设计并化学合成四组小分子干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。用INTERFERin转染试剂转染FAM标记的siRNA，流式细胞仪检测转染效率可达90%。通过RT-PCR筛选出具最佳抑制效果的序列——siRNA-4，10nMsiRNA转染24h后RT-PCR检测抑制效率77%；siRNA-1、2也有一定程度的抑制。siRNA-4对于HO-1基因的最佳作用浓度为10nM，mRNA水平抑制最佳作用时间为24h。体外经浓度梯度、时间梯度检测证实3

3、µg/mL血红素刺激，就能诱导HO-1高表达，18h诱导效果最好。siRNA-4亦可降低被诱导HO-1蛋白表达，实验证实最佳作用时间36h，抑制效率可达64%。我们通过对7~10天龄SD大鼠3次腹腔注射50µM/（100g体重）ALA能诱导HO-1表达和血清胆红素生成，HO-1升高到原来3倍，总胆、直胆。间胆浓度都升高，依此构建新生鼠黄疸模型。此模型大鼠经腹腔注射半甲氧基修饰的siRNA-4，实验证实5OD/（20g体重）剂量siRNA-4注射2d后对总胆红素抑制效率43%，10OD/（20g体重）抑制效率50％；HO-1蛋白抑制效率各为30%和42%。5OD/（

4、20g体重）剂量注射时，最后一次注射后1天、2天、3天总胆红素的降低效果分别是36%、45%、27%，HO-1蛋白抑制效果分别是26%、33%、18%。体外、体内实验表明，运用分子生物学技术设计合成的siRNA-4能够有效抑制干扰HO-1基因表达，进而减少胆红素产生，为早期防治新生儿黄疸和胆红素中毒性脑病提供了一条新的有效途径依据。关键词：血红素加氧酶，RNA干扰，胆红素，黄疸THEAPPLICRTIONOFsiRNAINTHETREATMENTOFNEONATALRATJAUNDICEBYINHIBITINGTHEEXPRESSIONOFHO-1GENEABST

5、RACTNeonataljaundicecausedbyincreasedbilirubinloadanddecreasedbilirubinexcretionisacommondiseaseinthenewborn.Abouttwothirdsofnewbornmightsufferfromneonataljaundice.Bilirulincandoharmtothenervesystem.Seriousjaundicemaydeveloptobilirubintoxicencephalopathy,whichmayleadtochildrendysnoesi

6、aandevendeaththereforeresultedinhighlethalityanddisability.HOisarate-limitingenzymeinthemetabolicpathwayfromhemintobilirubin,amongwhichHO-1canbeinducedbymanyfactors.Inourstudy,RNAi(RNAinterference)wasusedtoreducetheexpressionofHO-1inBRLcelltoprovethatbilirubinproductioncouldbedisrupte

7、dbyinhibitingHO-1expression.Next,themosteffectivesiRNAwasscrenedandadministeredtoratswithneonataljaundicetoexamineitseffect.Ourultimateaimistofindoutapossiblenewstrategyforearlypreventionandtreatmentofneonatalhyperbilirubinemiaandbilirubintoxicencephalopathy.FourpairsofsiRNAsweredesig

8、nedan