新型活性饲用微生物添加剂研制及生物活性评价

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1、万方数据学校代码：10225学号：B14014学位论文新型活性饲用微生物添加剂研制及生物活性评价指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：王朝『；赵敏教授博士2014年3月东北林业大学学科专业：微生物学论文答辩日期：2014年6月12日授予学位日期：答辩委员会主席：论文评阅人：聋方厶栉素大擎万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：B14014DissertationfortheDegreeofDoctorpreparationofanewmicrobialadditivesandevaluat

2、ionofitsbiologicalactivityCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：WangnaZhaominDoctorMicrobiologyJune12，2014NortheastForestry万方数据摘要微生物制剂以其无毒、无残留、无耐药性及低成本、可有效补充消化道有益微生物等诸多优点，成为替代抗生素的理想制品之一，而被广泛应用。本文从仔猪的粪便

3、中分离鉴定的益生菌一蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，又外购了2个益生菌：鼠李糖乳杆菌(1actobacillusrhamnose)、戊糖乳杆菌(1actobacilluspentose)。以这3株细菌为研究对象，对3株益生菌分别进行培养和发酵条件优化，以期用廉价培养基成分获得到较高的活菌数；然后对3株益生菌的稳定性、抗逆性、菌种间的最佳配比及制得的微生物制剂的饲料酶活性进行研究，研究了复合微生物制剂对断奶仔猪生产性能、肠道定植和肠道菌群等的影响。获得如下研究结果：从待分离样品中，经分离、纯化，生理生化鉴定和16SrDNA测序分

4、析，分离到一株肠道益生菌一蜡样芽孢杆菌。经过安全性检验可知，该菌株安全、无毒副作用，可作为制备微生物制剂的备用菌株。采用单因素试验及正交试验的方法对分离筛选到的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)及外购的鼠李糖乳杆菌(1actobacillusrhamnose)、戊糖乳杆菌(1actobacilluspentose)分别进行培养基组成和培养条件优化，获得lactobacilluspentose最佳培养基配方为o．5％乳糖+O．5％废糖蜜，0．5％棉粕粉，0．15％磷酸二氢钠+0．15％磷酸氢二钠；Bacilluscereus最佳培养

5、基配方为0．5％蔗糖+0．5％废糖蜜，1％棉粕粉，0．1％氯化钠；鼠李糖乳杆菌的最佳培养基配方为0．5％乳糖+o．5％废糖蜜，O．5％棉粕粉，0．3％磷酸二氢钠+磷酸氢二钠。最优发酵条件，即lactobacillusrhamnose最佳发酵条件为：发酵时问24h，起始pH为6．5，温度为35℃，接种量5％，装液量20％；蜡样芽孢杆菌最佳发酵条件为：发酵时间28h，起始pH为7．5，温度37。C，接种量7％，装液量40％；鼠李糖乳杆菌最佳发酵条件为：发酵时间28h，起始pH为7．0，温度37℃，接种量7％，装液量40％。最后，以各自优化后的最

6、佳培养基配方和发酵条件，活菌数分别达1．32x109cfu／ml、1．15×109cfu／ml和1．66×109cfu／ml。对3株益生菌的耐热性、肠道耐受性及贮存稳定性进行研究。结果表明，在65℃的条件下，蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖乳杆菌的存活率分别为92．54％、90．43％和87．01％，说明3株益生菌均具有较好的耐高温性质。体外模拟动物肠道耐受性试验结果显示，3株益生菌均能在pH为1．5的胃液中处理3h后保持106活性以上达，说明3株益生菌均能够在正常仔猪胃肠道中耐受较低pH；并且，3株益生菌均能在胰蛋白酶溶液处理3h后维持活

7、菌数为108，在0．40％的胆汁溶液巾维持活菌数在106以上，说明，3株益生菌均能够耐受胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液等消化酶的作用，完全可以耐受仔猪的胃液并进入小肠发挥益生作用。贮存稳定性试验结果表明，加有保护剂(5％葡萄糖溶液)、．7℃(冷冻)条件下贮存的菌粉稳定性明显高于其他组，90d后活菌数量仍保持在109cfu／g水平。万方数据摘要通过急性毒理试验表明，以1：1：1比例混合的3株益生菌对小鼠一般体征、行为、活动、毛发、色泽、饮食、粪便均未有明显不良反应，小鼠未出现死亡现象；各组体重持续增长，与对照组相比，试验组体重变化无显著性差异(P

8、>0．05)；肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数无显著性变化，可初步判定混合益生菌无毒性。通过将1：1：1混合的3株益生菌分别与大肠杆菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(s