建立离体兔眼试验方法及其替代draize试验的应用研究

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1、中山大学硕士学位论文建立离体兔眼试验方法及其替代Draize试验的应用研究姓名：郭翔申请学位级别：硕士专业：卫生毒理学指导教师：杨杏芬20090602中山大学硕士学位论义建寺离体兔眼试验方法及其替代DraiTe试验的应用研究建立离体兔眼试验方法及其替代Draize试验的应用研究·专业：卫生毒理学硕士生：郭翔指导教师：杨杏芬教授中山大学公共卫生学院广东省疾病预防控制中心(广东省卫生检验中心)中文摘要眼刺激是指外源化学物接触眼表面后使眼产生的可逆件炎症反应。一卜世纪40年代Draize等刨立了家兔眼刺激性试验(Draizc

2、test)，此试验一直应用于化学物的眼刺激性检测。几十年来，Draize试验在化学物的眼刺激性毒理学安全性评价，保护人群健康方面做出了巨大贡献。近年来，随着科学技术的进步，社会动物福利和动物保护意识的提高，“3R”理论(减少Reduction，优化Refinement，替代Replacement)的不断深入人心，同时鉴于Draize试验本身存在评分标准主观性强，实验室问检测结果重复性差和造成动物较大痛苦等缺点，Draize试验面临着越来越多的批评和谴责。为此欧盟(EuropeanUnion，EU)、美国、日本及其他国家

3、和地区开展了有关眼刺激性试验替代方法的研究与评价工作，2003年欧盟在化妆品规程(76／768／EEC)第7次修正案(2003／15／EC)中明确规定：从2009年起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏试验，2013年禁止使用动物进行化妆品及原料的毒理学安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行过动物试验的化妆品。自二十世纪八十年代国外学者开始探索用离体试验方法替代整体动物试验以来，眼刺激性体外替代方法的研究取得了较大进展，建立了离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验、体外细胞毒性与功能试验、体外组织重组模型等多

4、种体外方法，在此基础上部分研究者还推荐通过合适的统计学方法和‘本课题受卫生公益性行_k科研专项经费(200802080)资助l中山J：学硕士学倚论史建市离体兔眼试验方法及其替代Draize试验的应用研究检测策略以增强它们应Ⅲ的有效性。我国有研究者对眼刺激试验的替代方法进行了初步的探索，先后建立了鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜．台盼蓝染色试验、3T3成纤维细胞中性红摄取试验、荧光素漏出试验以及红细胞溶血试验等眼刺激试验的替代方法，但研究发现各种方法均有其适用范围和局限性，迄今在应用上尚不能直接使用单一方法替代整体动物

5、试验，迫切需要针对多个观察终点建立更多的替代试验方法，进而建立综合检测策略。而我国在此方面与国外相比差距仍较大，为了加速我国同因际接轨的步伐，使我国化妆品出口能早日打破贸易技术壁垒，也使我国对进U化妆品的毒理学安全性评价技术与国际通用方法体系对接，很有必要建立更多适合我国国情的眼刺激性试验替代方法，以期将多种方法有机组合、优势互补、最终构建检测策略，为眼刺激性体外替代方法应用于化妆品及其他化学物(工业化学品、农药和消杀产品等)的毒理学安全性评价工作提供科学依据。研究目的1．通过探索离体兔眼(isolatedrabbit

6、eye，IRE)刺激性试验的试验条件和研制“离体眼球表面灌流系统”，建立及评价IRE试验方法。2．应用IRE试验和传统的Draize试验对26种参照化学物和26种化妆品的眼刺激性进行捡测，评价分级结果的相关性和一致性、IRE试验的可靠性以及IRE试验对不同刺激性受试物的预测能力。材料与方法1．受试物26种参照化学物(均为化妆品原料)和26种洗发护发类、染发类、烫发类和洗面奶类化妆品。2．传统的动物眼刺激性试验参照我国卫生部《化妆品卫生规范》(2007年版)，选用健康成年白色新西兰家兔进行传统的整体动物眼刺激性／腐蚀性试

7、验，即Draize试验。H中山大学硕士学付论文缝市离体兔毗试验方法及其替代Draize试验的应用研究3．离体眼球表面灌流系统的研制及功能评价在文献报道基础上，应用仿生学原理，结合本实验室实际情况，自行设计制作离体眼球表面灌流系统，从而达到离体眼球体外维持的目的。选取8只经检测未发-牛损伤的离体兔眼，将离体兔眼置于表面灌流系统中，在0．5h、1h、2h、3h、4h观察离体兔眼的角膜混浊度、荧光素滞留、角膜水肿率及病理学改变，从而判断离体眼球表面灌流系统对离体兔眼的体外维持效果。上述试验共进行三次，以了解该系统维持能力的稳

8、定性。4．IRE试验方法的建立及受试物的检测IRE试验参照欧洲替代方法验证中心(EuropeanCentrefortheValidationofAlternativeMethods，ECVAM)推荐的试验方法进行。第～阶段选用部分受试物采用4s、lOs和30s三种不同的处理时间进行IRE试验，确定最佳的受试物处理时间。第二阶段和第