microrna-34a在年龄相关性白内障的表达改变与其对人晶状体上皮细胞凋亡作用的机制分析

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1、万方数据中文摘要第一部分MicroRNA．34a在ARC的表达及其启动子甲基化水平目的探讨microRNA一34afmiR-34a)在年龄相关性白内障(ARC)中的表达及其启动子甲基化程度改变。方法收集ARC晶状体前囊膜30例，透明晶状体前囊膜18例，采用RT—PCR检测miR一34a和miR-933的表达水平，并评价其表达在两组间的差异；选择在ARC组较对照组表达差异最显著的miR-34a为研究对象，在12例ARC前囊膜及8例透明对照前囊膜组织进行焦磷酸盐测序，检测miR-34a启动子区DNA甲基化程度。结

2、果miR-34a在白内障组表达高于透明晶状体组(P<0．05)，miR-933的表达水平未见明显差异(P=0．69)；其启动子甲基化程度在两组间无显著差异(P=0．152)。结论miR-34a在ARC前囊膜表达升高，可能参与了ARC发病。第二部分MicroRNA．34a调控人晶状体上皮细胞凋亡相关功能研究目的研究miR-34a对HLECs凋亡的影响。方法体外培养人晶状体上皮细胞系SRAOI／04，将miR．34a双链模拟物(miR-34amimics)和阴性对照模拟物(negativemimics)分别转染至

3、人晶状体上皮细胞系。转染后24至72小时，流式细胞仪分析miR-34a转染后细胞凋亡的改变，并检测caspase3／7活性；WestemBlot寻找上游激活靶蛋白：荧光显微镜观察JC—l染色后线粒体内膜电位改变，WB检测细胞质及线粒体细胞色素c(Cvt0C)含量评价线粒体外膜功能：提取细胞总RNA，分析线粒体呼吸链上相关功能基因的表达；DCFH．DA探针法检测细胞内活性氧积聚程度。结果miR-34amimics转染48小时后SRAOI／04发生早期及晚期凋亡的比例较对照组增加(P<0．05)，活化的caspa

4、se3／7表达升高(P<0．05)。JC一1染色提示miR-34a过表达导致晶状体上皮细胞线粒体内膜电位下降，WB显示CytoC的含量在胞浆中显著大于线粒体内，说明线粒体外膜通透性增加、功能受损；同时线4万方数据中文摘要粒体呼吸链上相关基因NDUFS8、COX5b和ATP5al表达明显下降，提示线粒体呼吸链电子传递功能受损；DCFH探针荧光在miR-34a组显著高于对照组，提示miR-34a过表达导致自由基产生，使胞内活性氧基团(I的S)蓄积诱发氧化应激反应。结论晶状体上皮细胞中miR-34a过表达可通过损伤

5、线粒体功能而导致细胞凋亡。第三部分MicroRNA一34a调控人晶状体上皮细胞凋亡的机制研究目的研究miR-34a在转录水平调控人晶状体上皮细胞凋亡的具体机制。方法联合利用生物信息学分析网站(Pictar、TargetScan、MiRanda)筛选miR-34a的候选靶基因，绝对定量PCR验证晶状体上皮细胞中候选靶基因的表达，在转染miR-34a模拟物与阴性对照模拟物的SRAOI／04中利用相对定量PCR和WB检测靶基因表达；构建miR-34a与靶基因3’UTR互补结合的质粒，共转染至HEK293一T细胞，并

6、用双荧光素酶报告基因分析在转录水平进行靶基因验证。确定靶基因后，转染靶基因的si．RNA以实现靶基因敲减，再次利用流式细胞、caspase3／7活性与caspase9的WB评价细胞凋亡及线粒体功能的改变。结果筛选出靶基因Notchl、Notch2、Jagl、Ja92均位于Notch通路并在晶状体上皮中表达，Notchl及Notch2是此通路中关键的受体蛋白基因，PCR及WB显示在转染miR．34a模拟物的晶状体上皮细胞中Notchl及Notch2的表达较对照组受到抑制；双荧光素酶报告基因分析显示Notchl和

7、Notch2的3’UTR萤火虫活性在miR-34a过表达组显著抑制(P<0．05)，而突变型质粒则对miR-34a过表达及阴性对照组间萤火虫荧光活性无明显改变(Notchlmutant,P=0．720：Notch2mutant，P=0．814)，由此确定miR一34可直接与Notchl、Notch2的3’UTR结合抑制其表达。进而在晶状体上皮细胞中将Notchl及Notch2基因敲减，进行流式凋亡功能检测及caspase3／7活性检测，发现Notchl敲减组细胞凋亡及caspase3／7活性增加不显著(P=0

8、．276)，而Notch2敲减组细胞早期及晚期凋亡显著增加(P<0．05)，caspase3／7活性也较对照组显著升高(P<0．05)。并且在Notch2敲减组的晶状体上皮细胞中线粒体凋亡标志蛋白caspase9的表达显著升高。5万方数据中文摘要结论miR-34a通过抑制靶基因Notch2表达诱导晶状体上皮细胞凋亡。关键词mieroRNA．34a．人晶状体上皮细胞．凋t．年龄相关性自内障．Notch