磷酸二酯酶2改善应激诱导的抑郁及学习记忆行为变化

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1、温州医学院硕士学位论文磷酸二酯酶2改善应激诱导的抑郁及学习记忆行为变化姓名：陈玲申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：潘建春2012-05-27温州医学院硕士学位论文磷酸二酯酶2调节应激诱导的抑郁及学习记忆行为变化摘要一．磷酸二醑酶一2抑制剂对皮质酮诱导的神经毒性及相关行为变化的调节目的：探讨磷酸二酯酶-2(PDE2)抑制剂对皮质酮诱导的神经细胞毒性作用和相关行为变化的调节作用及可能机制。方法：原代海马神经元细胞给予皮质酮后用免疫印迹法检测神经元细胞中皮质酮对PDE2蛋白表达的时间和剂量依赖关系，然后用HT-22

2、细胞系代替原代海马神经元细胞，皮质酮培养后，采用Realtime—PCR技术检测给予不同剂量皮质酮24h后11T-22细胞中PDE2三个不同亚型的mRNA的表达，然后用免疫印迹方法进一步检测其皮质酮对HT-22中PDE2总蛋白表达的影响。采用MTT法检测PDE2抑制剂Bay60-7550对皮质酮诱导的HT-22细胞死亡是否具有逆转作用，并且用PKA和PKG受体拮抗剂H89和KT5823初步探索Bay60-7550产生神经保护作用的可能机制。为进一步验证其作用机制，用ELISA法检测皮质酮培养HT-22细胞后细胞中c

3、AMP和cGMP的水平。然后采用免疫印迹检测Bay60-7550对pERK、pCREB、CBP以及BDNF等与抑郁密切相关蛋白的表达影响。最后用体内实验进一步验证Bay60-7550对抑郁症的影响，探究其对慢性不可预知性应激小鼠的是否有抗抑郁作用。采用悬尾实验和新奇进食抑制实验两种经典的动物抑郁模型来研究，最后用ELISA方法检测小鼠体内的皮质酮含量，多方面探究皮质酮和PDE2之间的因果关系。结果：实验结果显示，原代海马神经元细胞给予皮质酮后，皮质酮能使原代海马神经元内PDE2蛋白表达明显增高，并呈现时间和剂量依赖

4、关系，在皮质酮孵育24h以及50um浓度时，PDE2表达达到最高，而此变化可被糖皮质激素受体拮抗剂RU486(2．5IJm)所阻断，说明皮质酮对原代海马细胞内PDE2蛋白表达响具有特异性。Realtime-PCR结果显示，皮质酮对HT-22细胞内PDE2三种mRNA亚型表达均具有影响，其中对PDE2A3mRNA表达影响最显著，而且皮质酮也使该细胞系内PDE2A总蛋白表达升高，该作用同样可被糖皮质受体拮抗剂RU486(2．5pm)所拮抗。MTT检测结果显示，Bay60—7550可以逆转皮质酮诱导的HT一22细胞死亡，

5、Bay60-7550(0．5pm)具有神经保护趋势但是没有统计差异，当剂量达到1um时，Bay60—7550和皮质酮组相比具有统计学差异，而Bay60-7550的神经保护作用可被PKG受体拮抗剂KT5823所阻断，但PKA抑制剂则无此作用，因此可以初步推测Bay60-7550的神经保护作用可能通过cGMP／PKG信号转导通路产生。ELISA法检测HT一22内cGMP和cAMP水平结果显示，Bay60-7550显著2温州医学院硕士学位论文升高皮质酮诱导的cGMP水平下降，其对cA船具有升高趋势但无统计性差异，和MTT

6、结果一致。通过westernblot法检测Bay60—7550对HT一22胞内P—ERK、pCREB、BDNF蛋白表达含量结果显示，用Bay60-7550培养细胞24h后对pERK表达无显著性影响。本实验采用不同时间点给予皮质酮发现，在给药2h后，皮质酮使细胞内pERK表达显著增高，之后又逐渐降低，24小时后恢复正常，给予Bay60—75502h后发现它能逆转此时由皮质酮诱导的细胞内pERK表达的升高。而且Bay60—7550给予细胞24h后对细胞内pCREB无显著性影响，但是能明显提高其共活化物CBP的表达，Ba

7、y60-7550也能显著提高由皮质酮诱导的HT一22细胞内脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。在体内实验中，Bay60—7550对慢性应激小鼠具有明显抗抑郁作用，悬尾实验中明显缩短慢性应激导致的不动时间增长，在新奇进食抑制实验中能缩短慢性应激导致的摄食潜伏期增加。最后ELISA结果显示，Bay60-7550能明显降低慢性应激引起的小鼠血清皮质酮水平增加，进一步揭示PDE2和慢性应激之间的因果关系。结论：综上所述，PDE2可能参与调节皮质酮诱导的对海马神经元的神经细胞毒性。Bay60-7550逆转皮质酮诱导的海马细

8、胞病变和cGMP，pERK，CBP和BDNF水平异常，可以推测cGMP／PKG—pERK-BDNF的途径和Bay60-7550对拮抗皮质酮损伤的的神经保护作用具有一定的相关性。Bay60—7550能逆转应激小鼠的抑郁样行为和皮质酮过度分泌，进一步验证了PDE2参与了Bay60-7550对应激损伤的改善作用。二．PDE2抑制剂对慢性应激诱导的神经可塑性改变及相