stim1stim2调控人外周血单核细胞性树突状细胞fcγrii功能

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1、中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文STIM1/STIM2调控人外周血单核细胞性树突状细胞FcγRII功能院（系）、所临床医学院研究生姓名孙志娟学科、专业内科学导师姓名刘毅教授二Ο一二年四月目录1STIM1/STIM2调控人外周血单核细胞性树突状细胞FcγRII的功能„„„„„„„„„„„„„„„„„„11.1中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11.2英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„51.3前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„91.4材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„131.

2、5结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„331.6讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„461.7结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„521.8参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„531.9英汉缩略词对照表„„„„„„„„„„„„„„„„„582致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„603FcγR对树突状细胞成熟及效应功能的研究进展（综述）„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„61STIM1/STIM2调控人外周血单核细胞源性树突状细胞FcγRII功能摘要背景树突状细胞（D

3、Cs）是体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APCs)，直接调节机体免疫应答和免疫耐受之间的平衡。DCs的双向调节功能与其自身发育的不同阶段密切相关，同时DCs的分化成熟又与其表面FcR表达密不可分。我们前期研究发现DCs及其前体细胞表面的激活型和抑制型FcγR参与调控细胞的分化成熟和免疫学功能。FcγR参与DCs分化、成熟以及免疫效应主要由其自身激活型基序（ITAM）和抑制型基序（ITIM）所决定的。基质交感分子-1(STIM1)2＋是近年发现的Ca通道调节蛋白，堪称细胞内质网上侦测钙离子含2+量的感应器（sensor），是―填充式Ca涌入理论

4、‖（capacitativecalciuminflux）体系中的重要分子，具有潜在的有效调节DCs免疫功能的作2+2用。基质交感分子-2(STIM2)是调控基础Ca流入的主要分子，在Ca＋2+通道应答的后期阶段扮演重要角色。细胞Ca的流动不但参与调节T、B等免疫细胞的功能，同时也是细胞表面免疫受体胞内共有的ITAM和ITIM发挥激活和抑制功能的主要元素。由于FcRs发挥功2+2+能是通过胞内ITAM和ITIM引起Ca的流动实现，而Ca的流动本身可能是影响DCs分化成熟的重要环节。因此，探索STIM1和STIM2在FcRs调控DCs分化成熟中的作

5、用对阐明DCs的免疫调节机制，1发掘DCs调控免疫反应的靶点有重要的科学意义。目的：通过探讨STIM1及STIM2在FcR调控树突状细胞成熟中的作用，阐明STIM1和STIM2在DCs发挥免疫调节中的作用。方法：1.DCs体外培养体系的建立采用密度梯度离心法，分离人外周血单个核细胞（PBMC）利用单核细胞贴壁特性，获取单核细胞。采用重组人白细胞介素-4（rhIL-4）100ng/mL联合重组人粒细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）100ng/mL刺激6天收获未成熟DCs（iDCs）；第6天加入脂多糖（LPS）1μg/mL刺激24h后收获成熟DCs

6、（mDCs）。采用倒置相差显微镜观察DCs形态学变化，流式细胞仪鉴定DCs表型。2.激活FcR受体对STIM1和STIM2表达的影响流式细胞仪和免疫荧光检测DCs表面激活型受体FcγRIIa和抑制型受体FcγRIIb的表达；Real-timePCR和Western-Bolt检测iDCs和2mDCs中STIM1和STIM2的表达差异；分别采用IV.3和7.3与F(ab’)结合形成免疫复合物，分别交联DCs表面激活型和抑制型FcγR后，使用Real-timePCR和Western-Bolt检测交联3min和30min后，细胞内STIM1和STIM2的

7、表达差异。3.STIM1和STIM2的RNA干扰体系建立及鉴定采用化学法合成siRNA，通过Lipo化学转染法递送siRNA进入DCs，采用Real-timePCR技术检测转染效果，MTT法检测转染24h2后细胞活性。4.调节STIM1和STIM2的表达对DCs成熟的影响采用siRNA技术分别沉默DCs中STIM1和STIM2的表达，流式细胞仪检测DCs表型。结果：1.iDCs高表达抑制型受体FcγRIIb(MFI，1572±114.6)，LPS诱DCs成熟后FcγRIIb中度降低(MFI，900±21)，激活型受体FcγRIIa表达未见明显变化(

8、MFI，740±51）。2.DCs高表达STIM2，而DCs成熟后STIM1的表达明显增高(P<0.05)。采用siRNA