p38信号转导通路介导黄曲霉素g1致肺泡ⅱ型上皮细胞凋亡的研究

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时间:2019-02-16

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1、河北医科大学硕士学位论文P38信号转导通路介导黄曲霉素G1致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的研究姓名:左雅蓓申请学位级别:硕士专业:病理学与病理生理学指导教师:张祥宏201203中文摘要P38信号转导通路介导黄曲霉毒素G,致肺泡¨型上皮细胞凋亡的研究摘要目的:黄曲霉毒素(Aflatoxins,AF)是黄曲霉菌(Aspergillusflavus)等真菌产生的具有致癌作用真菌毒素,包括AFBl、B2、Gl、G2和Ml等。黄曲霉毒素Gl(AflatoxinGl,AFGl)在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出攀很高,是当地粮食主要的污染真菌毒素。本研究室前期实

2、验发现采用含有AFGl的饮食可以诱导实验动物肺癌。同时发现长期灌胃AFGl诱发的NIH小鼠肺腺癌组织来源于鼗型肺泡上皮细胞(Alveolartypellcells,AT-II)。进一步整体和细胞水平上研究发现AFGl对大鼠肺AT-II具有致损伤生物毒性作用,提示AT-II可能是AFG。作用肺组织诱发腺癌发生的靶细胞。认识和探讨其致AT-II生物毒性效应和机制可以为揭示AFGI与肺腺癌发生的可能关系提供科学依据。研究发现许多致癌性真菌毒素早期毒性作用是导致细胞凋亡或增殖抑制。包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素Bl等多种真菌毒素都是通过激

3、活靶细胞上MAPK通路的一条或多条,而诱导细胞凋亡,发挥其致损伤生物毒性作用。丝裂原活化的蛋自激酶(mitogen.activatedproteinl(inase,MAPK)级联是细胞内重要的信号转导系统之一,参与细胞的各种生理及病理活动,包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK(细胞外信号调节激酶)通路,JNK/SAPK(c.Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶)通路和p38MAPK通路。所以探讨AFG】通过激活MAPK通路丽对AT-II细胞凋亡的影响,对进一步认识AFGl致AT-II细胞毒性作用机制具有重要意义。我们研究室前

4、期采用具各人H型肺泡上皮细胞生物学特点A549细胞作为研究对象探讨AFGl致AT-II细胞毒性作用的可能机制,发现AFGi激活MAPK家族之一JNK信号转导通路参与其毒性作用。但是AFGI是否通过激活ERK和p38通路致AT-II细胞凋亡而介导其生物毒性作用还不清楚。在前期实验基础上,本研究采用A549细胞作为研究对象,探讨不同中文摘要剂量AFGl对AT-II细胞凋亡以及ERK和p38MAPK信号通路激活的影响;此外通过给予阻断剂,进一步研究信号通路在AFGl诱导AT-II细胞凋亡中的调控作用。旨在明确AFGl通过激活MAPK通路而诱导AT-II细

5、胞凋亡,以期揭示AFGl致AT-II细胞毒性作用可能分子机制。方法:1细胞培养与AFGl处理A549细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%c02培养,细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予溶解DMSO的AFGI,使其终浓度分别为O.5、2、4和10mg/L,溶剂对照组给予终浓度为1%的DMSO,继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。2p38和ERK阻断剂预处理对数生长期A549细胞,分别给予10rtMSB203580(p38的阻断剂)

6、或者10州PD98059(ERK的阻断剂)预处理30min。实验分为4组,即溶剂对照组、阻断剂组、2mg/LAFGl处理组和阻断齐lJ+2mg/LAFGl处理组。细胞处理24h后收集细胞检测相关指标。3p38特异性siRNA转染实验组给予100pmolp38特异性和Negativecontrol(NC)siRNA转染细胞,再加入2mg/LAFGl继续培养24h。对照给予100pmolNCsiRNA转染细胞后,加入DMSO培养24h。4流式细胞术检测细胞凋亡(FCM)分别收集各组细胞,PBS洗涤,离心收集细胞,采用AnnexinV和PI细胞染色,FC

7、M检测细胞凋亡。5蛋白免疫印迹(Westernblot)细胞给予处理24h后,提取细胞总蛋白,用蛋白免疫印迹方法,检测ERK/磷酸化型ERK、p38/磷酸化型p38以及凋亡相关蛋白Bax和Bcl一2的表达情况。6统计采用SPSSl3.0软件进行相关分析与单因素方差分析(analysisofvariance.ANOVA),数据用;虹表示,检验以P<0.05为差异有显著性意中文摘要义。结果:lAFGl对解II细胞凋亡的影响FCM结果显示,AFGlO.5、2、4、10mg/L处理细胞24h后,细胞凋亡率分别为7.82:t:0.47%,11.OO士1.02

8、%,15.30-i:3.14%和20.04士0.45%,明显高于对照组6.33+0.65%,并且存在明显的剂量依赖关系(P

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