caspase-3,8,9在莱菔硫烷诱导人腺样囊性癌细胞系acc-m凋亡中的作用

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1、河北医科大学硕士学位论文Caspase--3,8,9在莱菔硫烷诱导人腺样囊性癌细胞系ACC--M凋亡中的作用姓名：岳磊申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：张英怀；王维丽201203中文摘要Caspase-3，8，9在莱菔硫烷诱导人腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中的作用摘要目的：涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，其发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位。嗜神经浸润性和易发生血行性转移是涎腺腺样囊性癌的主要特征。其发病机制目前尚不完全清楚，因此有必要以调控细胞周期，诱导细胞凋亡为靶点研究

2、肿瘤细胞凋亡的机制，探索新的治疗方法，提高患者的生存质量和生存率。Caspase的全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在细胞凋亡过程中起至关重要的作用。莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)是从十字花科类植物中提取的一种异硫氰酸酯，因其抗肿瘤效果佳而受到广泛关注。Caspase家族成员在肿瘤，缺血再灌注，炎症，组织损伤等过程中参与了多种细胞的凋亡，Caspase是细胞凋亡的中心环节。我们近期的研究表明，SFN可以抑制腺样囊性癌细胞系ACC．M的增殖，并诱导其凋亡。但是在SFN诱导ACC．M细胞凋亡的过程中，Caspase．3，8，9所起的作用，国内外尚未见报道

3、。本实验拟对体外培养的人腺样囊性癌ACC．M细胞经40ⅢviSFN处理后，采用分光光度法检测Caspase．3，8，9在不同时间点的活性的变化。并且采用流式细胞术检测经Caspase抑制剂Z．VAD．FMK预处理后，SFN诱导ACC．M细胞凋亡情况，从而研究Caspase．3，8，9在SFN诱导ACC．M细胞凋亡过程中的作用，探讨其可能的机制，并为临床上治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。材料和方法：1材料ACC．M：上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，建立于1995年；Caspase．3，8，9活性检测试剂盒及广谱Caspase抑制剂Z．VAD．FMK：购自碧云天生物技

4、术研究所；SFN：购自美国LKT实验室，纯度≥98％；细胞凋亡试剂盒(Annexin．V-FITC／PI试剂盒)：购自北京宝赛生物技术有限公司。中文摘要2方法2．1药液配制SFN：用DMSO配制成1009M储存液，．20。C冰箱储存。使用前用RPMI1640培养液稀释。Caspase抑制剂Z．VAD．FMK的配制：将20止Caspase抑制剂Z．VAD．FMK(20mM)放入4mLDMSO溶液中，配成1001．tM储存液混匀后适当分装备用。2．2细胞培养：采用加入10％胎牛血清和青霉素(100U／mL)、链霉素(100pg／mL)的RPMIl640培养基，在37。C、

5、5％C02恒温箱内饱和湿度下培养，当细胞爬满瓶底壁的80％时以0．04％EDTA和0．25％胰蛋白酶(1：1)混合液消化传代。2．3分光光度法检测Caspase．3，8，9活性：先利用pNA标准品制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。取对数生长期细胞制成2．0x105／mL细胞悬液接种于6孔板，继续培养24h后，弃去培养液，每孔加入浓度为40pM的SFN2mL。继续培养Oh(对照组)、4h、8h、16h和24h，收集细胞后以PBS洗涤一次，吸尽上清液，按照每20×105个细胞加入1009L裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解，离心后收集上清，即为待测样本。分

6、别将10止待测样本，80此检测缓冲液，10止Ac．DEVD—pNA(或Ac．IETD．pNA或Ac．LEHD．pNA)置于96孔板中，并设空白对照。将96孔板置于酶标仪上测定A405，通过与A405标准盐线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。然后分别绘制以时间为横轴，pNA的量为纵轴的Caspase．3，8，9活性图。2．4流式细胞术检测：实验分三组，先用最终浓度为50州的Caspase抑制剂Z．VAD．FMK预处理细胞2h，再用409MSFN处理细胞24小时作为实验组(SFN+Caspase抑制剂组)。以0．04％DMSO处理细胞24小时作为阴性对照组

7、(DMSO组)。以409MSFN处理细胞24小时作为阳性对照(SFN组)。获取细胞后，Annexin．V-FITC和PI双标记活细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。3统计学分析以上实验均重复三遍，使用SPSSl3．0统计学软件，应用单因素方差分析对pNA含量和细胞凋亡率进行统计学分析。中文摘要结果：1分光光度法检测Caspase．3活性：在SFN诱导ACC．M细胞凋亡过程中，Caspase．3的活性有明显升高，在16小时达到高峰，之后有所下降。经统计学分析，各时间组与空白对照组(Oh)相比，均有显著性差异(OhVS4h：P<0．01；OhVS8h：P<