应用蛋白质芯片技术研究hbv慢性肝病中医证型与细胞因子的相关性

《应用蛋白质芯片技术研究hbv慢性肝病中医证型与细胞因子的相关性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、镬》湖北中医学院2004级硕士研究生学位论文英文缩略词表7原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他任何个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：张闺赴学位论文使用授权说明日期：川矿7年箩月可日／本人完全了解湖北中医学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本；学校有权

2、保存学位论文的印刷本；在不以利为目的的前提下，学校可以公布学位论文的部分或全部内容。(保密论文在解密后，遵守此规定)论文作者签名：张J习趁导师签名：日期：姗7年6'月节日u-^x卜{}《够湖北中医学院2004级硕士研究生学位论文中文摘要目的：细胞因子是指由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称，研究发现Jmv慢性肝病的发生．发展及其演变与细胞因子密切相关。蛋白芯片是继基因芯片后发展起来的一种新的生物检测技术，它的出现对于生物学，临床检验医学、遗传学，肿瘤学和药理学等多学科的进步具有极大的推动

3、作用。目前国内检测细胞因子通常采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，但Ⅱ。珞A存在着灵敏度较低．重复性较差，分析范围较窄等问题，而具有快速，并行，自动化和高通量的特点蛋白芯片则可以弥补这些缺点．因此参考国内外文献，选取玎L，-2．IFN-T，几_4，TNF-o,，slCAM-I，TGF-IBI，TIMP-I等7种细胞因子做为研究靶点，自行构建蛋白芯片，分析蛋白芯片技术与传统的ELISA敏感性和特异性的差别；并借助蛋白芯片技术研究这7种细胞因子在不同类型的HBv慢性肝病中变化规律，寻求能够准确反应肝脏

4、炎症及纤维化程度的新指标；探讨慢性乙型病毒性肝炎，乙肝肝硬化患者不同中医证型与7种细胞因子的相关性，寻求中西医的交融之处，丰富中医“证”的微观指标学说，为慢性肝病中医“证”的客观化和规范化研究奠定基础。方法：将洗净的载玻片放入以l：50丙酮稀释的APES@，停留20--30s，取出后再用纯丙酮溶液冲洗。将7种血清标志物的单克隆抗体用PBs(0．01mol／L，pH7．0)稀释：0500mg／L，用Cartisiaa5500机器．人点样-于APES玻片上，每个样品设4个重复。将芯片放于3TC孵育4h

5、，用PBST洗涤3×15s，用封闭液于37"(2封闭2h，用PBST洗涤3次x15s，晾干备用。以500mg几生物素标记的BsA为阳性对照，用无生物素标记09500mg／LBSA为阴性对照。从．80℃冰箱中取出血清样品，置冰金上溶解后，l：．(50009，412离心5min。取10肚清，用样本稀释液稀释lO倍，40肚600D，min冰浴震荡30min．运用点样仪向每个反应孔中加AJ00I_d处理好的样品，37℃孵育lh，PBST洗涤3次，然后加入生物素标记的7种细胞因子的单克隆抗体20m(浓度为h

6、tg／m1)，3TC孵育lh，PBST洗涤3次，再加ACy3标记的亲和素，37"C孵育lh，PBST洗涤3次，晾干。将蛋白芯片用ScaaArray4000激光共聚焦扫描仪扫描成像，扫描后的图象用hI螂软件分析荧光强度，对所有原始数据根据单个膜阳性与阴性对照值进行标准化处理及减除背景处理，取4个反应孔荧光强度的平均值，通过标准曲线计算与分析结果。将蛋白芯片结果与EusA检测结果进行比较后，选择慢性乙型病毒性肝炎患者90例，其中轻，中，重度各30例，参照<够湖北中医学院2004级硕士研究生学位论文19

7、91年天津会议所制定的《病毒性肝炎中医辨证标准(试行)》进行辨证分型，湿热中阻型20例，肝郁脾虚型26例，瘀血阻络型2l例，肝肾阴虚型14例，脾肾阳虚型9例；乙肝肝硬化患者共90例，A，B，c级各30例，中医辨证g哮-t993年洛阳会议所制定的《肝硬化临床诊断，中医辨证和疗效评定标准(试行方案)》，其中肝气郁结22例，脾虚湿盛18例，湿热内蕴12例，肝肾阴虚7例，脾肾阳虚ll饲，血瘀证20例；慢性重型乙型病毒性肝炎30伪。借助蛋白芯片技术明确7种细胞因子在不同类型HBV慢性肝病的变化规律，并探讨其

8、与中医证型的相关性。结果：(1)成功构建血清细胞因子蛋白芯片，并建立良好的质控标准。预实验中比较了蛋白芯片与ELISA对IL-2、儿-4、TNF-a3种因子的敏感性，结果发现在对34例临床标本的检测中，蛋白芯片及ELISA法均未能检测到IL-2，儿-4，而蛋白芯片却检澳4到8例慢性乙肝重度患者血清中的TNFdl，ELISA法仅检测出其中的5倪。(2)慢陛肝病组7种细胞因子与正常对照组均有显著差异(P<0．05)，IL-2，口FN吖等Thl类细胞因子在慢乙肝轻度中水平基本正常，慢重肝